烙灸疗法通过Fas/FasL信号通路对髓核细胞凋亡的调节机制

马兰洁,杨忠明,许建峰,田 良,林瑞珠,童 昕,孙博文,尤 娜,李国豪

(1.宁夏医科大学 中医学院,宁夏 银川750004;2.宁夏医科大学总医院,宁夏 银川750004;3.宁夏医科大学 回医药现代化教育部重点实验室,宁夏 银川750004)

腰椎间盘突出后髓核重吸收(Resorption of herniated lumbar discs,RHLD)是指在没有外科手术或化学药物注射干预下通过保守治疗出现的自然吸收甚至完全消失的现象[1]。RHLD理论给中医药等保守疗法防治腰椎间盘突出症带来新的启示[2-3]。

我们前期实验发现:烙灸疗法不仅可以促进大鼠RHLD模型椎间盘的重吸收,促使突出髓核细胞的凋亡,还可以导致髓核组织中IL-1和Caspase-3的高表达。由此我们提出烙灸疗法可能是通过介导Fas/FasL信号通路促进腰椎间盘突出后髓核重吸收的假说。因此,本研究旨在阐明烙灸疗法通过Fas/Fas L信号通路对髓核细胞凋亡的调节机制,进一步探讨烙灸对腰椎间盘突出后髓核重吸收具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 选择健康Sprague-dawley(SD)大鼠120只,雄性,体重300g,宁夏医科大学动物中心提供,动物饲养于宁夏医科大学实验动物中心。动物合格证号:SCXK(宁)2011-0001。标准条件下饲养,每日自由摄取纯水和标准饲料饲养。实验前喂养5天以适应环境,经观察无异常后,按体重由轻到重进行编号(1~120号),然后采用SPSS 17.0统计软件包将大鼠随机分成4组:烙灸组、拮抗剂组、模型对照组和空白对照组每组各30只。除空白对照组30只大鼠以外,其余90只大鼠按腰椎间盘突出后髓核重吸收造模。

1.1.2 实验试剂 TUNEL试剂盒、DAB显色试剂、苏木素染液、苏木素分化液、苏木素返蓝液、PBS缓冲液、蛋白酶K、破膜液均购于Servicebio公司;无水乙醇、中性树胶购于国药集团化学试剂有限公司;二甲苯购于上海凌峰化学试剂有限公司。

1.1.3 实验设备 组化笔、载玻片、掌上离心机、脱色摇床、涡旋混合器均购于Servicebio公司;脱水机购于DIAPATH公司;包埋机、冻台购于武汉俊杰电子有限公司;病理切片机购于上海徕卡仪器有限公司;组织摊片机购于金华市科迪仪器设备有限公司;移液枪购于Dragon公司;显微镜、成像系统购于日本尼康公司;灸法所用艾绒购于宁夏医药公司[豫郑食药监械(准)字2012第1270003号]。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模 (1)尾椎切除:采用公认尾椎椎间盘腰椎硬膜外埋置的造模方法,烙灸组、拮抗剂组和模型对照组90只SD大鼠,20%乌拉坦(1 mL/100 g)经腹腔行注射麻醉,麻醉成功后,剃除尾部体毛,用橡皮筋扎住大鼠尾部,并进行常规消毒。无菌条件下,每只大鼠均切取包括2个完整间盘长度的尾椎,需包含上下软骨终板。用针刺破上下终板,使髓核暴露,造成游离状态或破裂状态。用7号手术线进行“米”字形包绕,切取尾椎后放入生理盐水器皿中备用。

(2)腰椎造模:大鼠腰椎的皮肤剃毛后常规消毒,无菌条件下沿后正中线后路切开背部皮肤、皮下组织及腰背筋膜,沿棘突剥离骶棘肌,用缝合线分开肌肉组织暴露腰椎,去掉L2-5椎板,露出腰椎硬膜。将取出的尾椎间盘小心放置在腰椎硬膜外,并取可吸收的明胶海绵贴在移植髓核表面,逐层缝合。烙灸组、拮抗剂组和模型对照组的大鼠从造模1月后进行干预,6月后进行取材。

1.2.2 治疗方法 (1)烙灸组:30只大鼠从造模1月后进行干预。固定在固定器上,沿大鼠腰椎纵轴方向进行剃毛,将特制的2 cm×0.5 cm×0.5 cm长方体铁制灸具以腰椎纵轴方向放置,覆盖L1-L6椎体表面,将铁制灸具的中心放置在大鼠L3-L4间隙,然后将灸槽内2 g艾绒点燃,经燃烧的艾绒可以使铁制灸具发热,并将热量向下传导使局部皮肤出现潮红,1次/d,每次10min。干预6月后进行取材。

(2)拮抗剂组:30只大鼠从造模1月后进行干预,首先在大鼠腹腔内注射抗Fas抗体,10μg/kg/week,烙灸干预方法同烙灸组,干预6月后进行取材。

(3)模型对照组:30只大鼠造模1月后在固定器上固定10min,每天1次,不予其他干预,固定6月后进行取材。

(4)空白对照组:30只大鼠不予造模和干预,6月后处死并进行取材。

1.2.3 取材 实验大鼠采用空气静脉栓塞法处死,取出埋置在腰椎硬膜外的尾椎椎间盘并剔除周围软组织,先行大体观察并记录,后用0.9%氯化钠注射液冲洗,一个放入4%中性甲醛溶液(p H=7.4)中固定1 d,10%EDTA脱钙3月,梯度酒精脱水,石蜡包埋,常规切片。

1.2.4 TUNEL细胞凋亡检测 严格按照TUNEL试剂盒操作,二甲苯溶液脱蜡清洗,逐级酒精水化;加入蛋白酶K工作液孵育,滴加100μL TUNEL的反应混合物,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中孵育,滴加二氨基联苯胺(DAB)显色液染色,脱水,用苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。在荧光显微镜下观察实验各组的变化情况。

1.2.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行大鼠分组和数据分析,采用ONE-ANOVY对TUNEL法检测的结果进行方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 髓核细胞凋亡的检测结果

采用髓核细胞的原位末端标记法(TUNEL法)检测实验各组尾椎间盘髓核细胞的凋亡情况,空白对照组凋亡指数为0,模型对照组为(20±5),烙灸组为(55±5),拮抗剂组为(30±5),模型对照组、拮抗剂组与烙灸组的髓核细胞凋亡指数明显高于正常对照组(P<0.05),而烙灸组的髓核细胞凋亡指数高于模型对照组及拮抗剂组(P<0.05)。以上数据提示,烙灸疗法可以促进大鼠椎间盘髓核细胞的凋亡。结果见图1及图2。

图1 各组髓核细胞凋亡形态组织学表现

图2 各模型组间TUNEL阳性细胞数

3 讨论

近几年,腰椎间盘突出症发病趋于年轻化,长期的久坐久站均会导致疼痛加重,伴有下肢的放射痛,严重影响患者的健康,是骨伤科的常见病、多发病。腰椎间盘突出的患者保守治疗无效时,唯一的治疗方式是手术切除,这将加剧家庭和社会的经济负担,同时给患者造成严重的心理负担和身体创伤。而烙灸疗法具有活血化瘀、利水消肿的功效,与其他保守治疗相比,具有明显的促进突出的髓核重吸收的作用,从而降低腰间盘突出症的复发率。烙灸疗法是中医化脓灸的发展与深化,具有刺激面积大、施灸量可控、患者容易接受等优点,在临床中对腰椎间盘突出后髓核重吸收的疗效较为突出。

腰椎间盘突出后髓核重吸收的中医病因病机为肝肾不足,寒邪、湿邪等六淫侵袭,致气滞血瘀,不荣则痛,发为腰痛,烙灸疗法具有温阳补肾、温经散寒、活血化瘀、利水消肿的作用,古代医家发现艾叶性味辛散,易于走窜,方便热力穿透肌肤而温通经络、祛风散寒、除湿止痛;《本草纲目》中记载艾叶能“温中,逐冷,除湿”;《名医别录》谓其能“主灸百病”。根据“菀陈则除之”“寒者热之、虚则补之”的治疗原则,烙灸施灸量大、热刺激强烈时可使皮肤破损形成脓疡,当破溃内“恶润”流出体外,发挥活血化瘀、利水消肿的功效,以达到治疗LDH髓核脱出的目的。髓核脱出组织是一个封闭的无血供组织,具有一定的自身免疫抗原,而当髓核组织游离于椎管内时,在烙灸干预下,促进其充分参与血运,使其更容易发生自身免疫反应,从而产生TNF-a和IL-1β等炎症因子,以激活Fas/FasL信号通路,诱发髓核细胞凋亡,加速髓核组织降解,促进腰椎间盘突出后髓核重吸收。

腰椎间盘突出后髓核重吸收现象的机制有多种学说,自身免疫、炎性反应、新生血管化、基质代谢平衡失调、椎间盘退变及髓核细胞凋亡等在重吸收的机制中发挥重要作用[4]。椎间盘突出后巨噬细胞浸润可伴有多种细胞因子释放,如IL-l、HIF-1、MCP-1等,这些细胞因子可通过多条信号通路(如Fas/FasL、MAPKs、NF-kappa B等)参与到生理活动的调节,并有可能在重吸收中发挥作用[5]。但是,目前认为Fas/Fas L信号通路可能是调控髓核细胞凋亡的重要通路之一,并且艾灸和针刺治疗都可以调控该信号通路[5、6]。

Fas又称Apo-1、CD95或TNFSF6,最初由Yonehara等在一种诱导细胞凋亡的单克隆抗体中发现[7],Park等在腰椎间盘细胞内发现了Fas的表达,且表达程度随椎间盘突出类型不同而各异[8],目前大部分学者认为,FasL在退变椎间盘中的表达呈下降趋势,且髓核细胞表达的FasL对椎间盘具有保护作用[9],为Fas信号通路在髓核组织重吸收的研究奠定了重要的基础。Fas的配体FasL(又称CD95L、CD178)于1993年由Suda等从细胞毒性T细胞杂交瘤PC60-d10S细胞系中成功克隆[10],其属于肿瘤坏死因子(TNF)家族,在细胞中主要以膜结合和可溶性两种方式存在[11]。因此,Fas信号通路是调控细胞凋亡的主要途径[12,13]。

有研究发现正常髓核组织中仅有Fas L的表达,突出的椎间盘组织中存在FasL、Fas、TNF-a和IL-1的表达,而且表达指数在破裂型组与非破裂型组之间差异有统计学意义[14]。前期研究表明回医烙灸疗法可以增加髓核组织中IL-1和Caspase-3的表达,而IL-1和Caspase-3是Fas/Fas L信号通路上下游重要作用因子[15]。Han等认为,Fas L能通过上调髓核细胞中Fas的表达而促进髓核细胞凋亡,且凋亡与FasL呈剂量依赖性[16]。Fasl与Fas结合后与细胞质连接蛋白的N端死亡域、Fas相关 死 亡 域(FADD)结合,通过半 胱 天 冬 酶 原-8(procaspase-8)的信号接受,最终形成死亡诱导信号复合物(Death-inducing signaling complex,DISC)。在半胱天冬酶-8(caspase-8)的启动后,激活下游的效应蛋白半胱天冬酶-3(caspase-3),引起蛋白酶水解和相关酶联反应,从而降解DNA,最终诱导细胞凋亡[17]。

本研究发现烙灸组的髓核细胞凋亡指数高于模型对照组及拮抗剂组(P<0.05),模型对照组的髓核细胞凋亡指数与拮抗剂组相比无明显差别,不具有统计学意义。说明烙灸疗法可以促进大鼠椎间盘髓核细胞的凋亡,从而减轻患者疼痛,提高了腰椎间盘突出症患者的生活质量,并且烙灸治疗简、便、易、廉,适宜临床推广,可节约大量的医疗费用和卫生资源[3]。