桃核承气汤对慢性肾衰竭大鼠的调控机制研究

张喜奎,王巧花,王旭丽,李灵辉,朱为坤

(1.福建中医药大学附属第二人民医院,福建 福州350003;2.福建中医药大学,福建 福州350122)

慢性肾衰竭(Chronic renal failure,CRF)指各慢性肾脏疾病进展至终末阶段而出现的临床综合征[1]。中医古籍中并无“慢性肾衰竭”这一病名,但根据其病机特点及临床特征,可将其归属于“关格”“肾劳”“水肿”“癃闭”等范畴。CRF病机错综复杂,病性多为本虚标实、虚实夹杂,常以脾肾亏虚为致病之本,浊毒瘀血内阻、三焦不利为致病之标。虚实互见、寒热错杂是其重要病理特点,瘀血浊毒内阻贯穿病变过程的始终[2]。桃核承气汤具有活血化瘀、通腑泻浊的功效,临床及实验研究均证实其为治疗CRF的有效方剂[3-5]。

慢性肾衰竭的发生受到多种细胞因子和分子因素的调节,病变机制复杂,其主要病理基础是肾纤维化。研究表明,Wnt/β-catenin信号通路的异常激活是肾纤维化发生发展的重要因素。β-连环蛋白(β-catenin)、结肠腺瘤息肉蛋白(APC)和T细胞因子4(TCF4)是Wnt/β-catenin信号通路的重要因子,在肾纤维化过程中起着重要作用,已被证实与慢性肾衰竭的发生关系密切。本实验用桃核承气汤干预CRF模型大鼠,综合大鼠一般情况、贫血指标、肾功能、肾组织形态以及β-catenin、APC及TCF4的mRNA和蛋白表达情况,以期探讨桃核承气汤对慢性肾衰竭大鼠的调控机制。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

从上海斯莱克实验动物有限责任公司(许可证号:SCXK(沪)2012-0002)采购125只7周龄雄性,体质量约在200g左右的Wistar大鼠,饲养于福建中医药大学实验动物中心。适应性饲养1周后开始实验。

1.2 实验药物与试剂

桃核承气汤饮片:桃仁12g、生大黄12g(后入)、芒硝6g(冲服)、桂枝6g、炙甘草6 g,购自福建中医药大学附属第二人民医院,煎煮并浓缩成42 g/100 m L的中药液,分装至EP管,保存于4℃冰箱备用。内蒙古康臣药业无糖型尿毒清颗粒(国药准字:Z20073256)与加热后的超纯水配成25%的溶液。

注射用青霉素钠(鲁抗制药,国药准字:H37020079);APC抗体(Abcam公司,英国,批号:ab40778);β-catenin抗体(三鹰生物技术有限公司,武汉,批号:51067-2-AP);TCF-4抗体(Abcam公司,英国,批号:ab76151);β-actin抗体(三鹰生物技术有限公司,武汉,批号:66009-1-Ig);逆转录试剂盒(Vazyme生物科技有限公司,南京,批号:R123-01);PCR试剂盒(Vazyme生物科技有限公司,南京,批号:Q311-02);PBS磷酸盐干粉(Solarbio科技有限公司,北京,批号:AR0030)。

1.3 实验仪器

低温高速离心机(Eppendorf公司,德国,型号:5424R);血液分析仪(SYSMEX公司,日本,型号:XT-2000iV);生化分析仪(Beckman公司,美国,型号:AU5800);实时荧光定量PCR仪(ABI公司,美国,型号:ABI7500);电泳仪(Bio-Rad公司,美国,型号:POWER PAC3000);光学显微镜(Zeiss公司,德国,型号:Axio Scope.A1);超薄切片机(Leica公司,德国,型号:UC-6型);透射电子显微镜(日立公司,日本,型号:H-7650型);电镜图像采集分析系统(SIS公司,德国,型号:VELETA型)。

2 实验方法

2.1 分组与造模方法

先将125只Wistar大鼠以随机的方式各抽取25只大鼠作为空白组和假手术组,其中空白组不做手术干预,假手术组仅行手术剥离双肾被膜;余下的75只大鼠参照文献[4]5/6肾切除方法建立CRF大鼠模型:即先切除左侧2/3肾脏,1周后再结扎并剪除右侧肾脏。术后第3周采血检测Scr水平检测造模是否成功,确认造模成功后再随机分成模型组、尿毒清组以及桃核承气汤组各25只大鼠。

2.2 干预方法

术后第4周开始对各组大鼠进行药物灌胃干预。参照实验动物常规换算法,大鼠每公斤体重的用药剂量参照标准成人每公斤体重用量的6倍[5],除桃核承气汤组和尿毒清组分别予桃核承气汤、尿毒清颗粒混悬液10 m L/(kg·d)灌胃外,余下3组大鼠则予等剂量生理盐水灌胃,灌胃时间为56 d。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 大鼠一般情况观察 观察并记录大鼠体型体态、活动情况、应激反应、饮食、二便及体质量变化等一般情况。

2.3.2 肾组织病理形态观察 灌胃56 d结束后,即予禁食不禁水24 h。各组随机抽取3只大鼠,在未取血的情况下麻醉大鼠后,暴露左侧肾脏,于皮质部分取约1 mm×1 mm×1mm的组织3~4块,迅速投入3%戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1MPBS和1%锇酸的溶液中进行双重固定,经乙醇-丙酮梯度脱水,环氧树脂包埋,半薄切片定位、超薄切片干燥,电子染色,最后于透射电镜下观察肾组织病理形态。

2.3.3 血常规、肾功能检测 麻醉大鼠后迅速打开腹腔,抽取腹主动脉血液运用血液分析仪和生化分析仪检测RBC、HB、Scr、BUN含量。

2.3.4 qPCR法检测 在采集大鼠血液标本后,快速摘取左残肾,将组织切分后装入冻存管,放置于-80℃冰箱保存。取100 mg肾组织进行RNA提取,测定浓度后行逆转录反应,分别取2μL PCR产物在实时荧光定量基因扩增仪进行qPCR反应。用2-△△Ct表示APC、β-catenin及TCF4相对表达量。引物序列见表1。

表1 肾组织β-catenin、APC、TCF4引物序列

2.3.5 Western blot法检测 取100 mg肾组织进行蛋白提取,用BCA法测定蛋白浓度;于待测样本中加入上样缓冲液,放置金属浴5 min,待蛋白充分变性;根据蛋白分子量配制SDS-PAGE胶进行电泳分离;经转膜、封闭后加入一抗、二抗进行孵育;最后在PVDF膜上滴入显影液,放入显影仪中曝光成像,用Image Lab软件分析肾组织中β-catenin、APC及TCF4的蛋白表达。

2.4 统计学方法

将实验所得数据用统计软件SPSS 25.0进行分析,统计结果用(±s)表示。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般情况

空白组与假手术组大鼠外形及精神状态良好,体重平稳增长;模型组大鼠体型较瘦,毛色枯槁,爪、尾色淡,反应迟缓,不喜活动,进食减少,大便质稀,个别大鼠存在“腹水”情况,体重增长缓慢;桃核承气汤组大鼠体型偏瘦,毛色偏暗,活动灵敏度一般,食量减少,粪质较稀,体重增长较慢;尿毒清组大鼠一般情况介于模型组与桃核承气汤组之间。各组大鼠体质量变化见表2、图1。

图1 各组大鼠体质量变化趋势

表2 灌胃前后各组大鼠体质量变化(n=17~25±s,g)

表2 灌胃前后各组大鼠体质量变化(n=17~25±s,g)

注:与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与尿毒清组比较,▲P<0.05。

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3.2 肾组织病理形态观察

如图2所示,正常组及假手术组大鼠肾组织形态正常,细胞结构镜下清晰可见,排列紧密规则。模型组大鼠细胞

图2 电镜下各组大鼠左肾组织形态(×10 000)

核固缩变形,部分溶解,细胞边缘不光滑,可见线粒体空泡,线粒体嵴模糊;肾小球内皮细胞和上皮细胞增生水肿,基底膜明显增厚,足突大面积融合;肾小管细胞形态排列紊乱,局部系膜基质增生,可见炎细胞浸润,绒毛脱落、消失。尿毒清组整体情况较模型组有所改善,可见脂质空泡,基底膜稍有增厚,足突部分融合,部分线粒体完整,可见明显的线粒体嵴。桃核承气汤组大鼠细胞结构相对完整,双层细胞核膜明显,细胞质中多数线粒体结构完整,可见线粒体脊;肾小球内皮细胞排列较为整齐,基底膜局部可见增厚,足突部分融合;肾小管上皮细胞排列紊乱,绒毛少量脱落。

3.3 贫血指标、肾功能检测结果

从各组大鼠RBC、Hb的实验结果来看,空白组与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05);尿毒清组与桃核承气汤组两组结果均低于空白组,但均较模型组升高,差异有统计学意义(P<0.05);尿毒清组与桃核承气汤组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图3、图4。

表3 大鼠红细胞、血红蛋白实验结果比较(±s)

表3 大鼠红细胞、血红蛋白实验结果比较(±s)

注:与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与尿毒清组比较,▲P>0.05。

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图3 各组大鼠RBC含量

图4 各组大鼠Hb含量

从各组大鼠Scr、BUN的实验结果看,空白组与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05);尿毒清组与桃核承气汤组结果均高于空白组,但均较模型组降低,差异有统计学意义(P<0.05);桃核承气汤组结果相对尿毒清组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4、图5、图6。

表4 各组大鼠血肌酐、尿素氮的实验结果比较(±s)

表4 各组大鼠血肌酐、尿素氮的实验结果比较(±s)

注:与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与尿毒清组比较,▲P<0.05。

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图5 各组大鼠Scr含量

图6 各组大鼠BUN含量

3.4 实时荧光定量PCR检测结果

如图7所示,空白组 与假 手术组APC、β-catenin和TCF4的mRNA表达水平无显著差异;桃核承气汤组APC的mRNA表达水平相对空白组降低(P<0.05),但较模型组和尿毒清组升高(P<0.05);桃核承气汤组β-catenin、TCF4的mRNA表达水平相对空白组升高(P<0.05);但较模型组与尿毒清组降低(P<0.05)。

图7 各组大鼠肾组织中APC、β-catenin、TCF4mRNA表达结果

3.5 Western Blot检测结果

如图8所示,空白组与假手术组APC、β-catenin和TCF4蛋白表达水平无显著差异;桃核承气汤组APC的蛋白表达水平较空白组降低,但高于模型组和尿毒清组;桃核承气汤组β-catenin、TCF4的蛋白表达水平较空白组升高,但低于模型组与尿毒清组。

图8 各组大鼠肾组织中APC、β-catenin、TCF4蛋白表达结果

4 讨论

慢性肾衰是多种慢性肾脏疾病的终末阶段,以肾脏结构被破坏、肾小球滤过率降低、肾功能严重受损、体内代谢产物潴留及酸碱平衡紊乱为主要病理表现。据流行病学调查显示,目前我国慢性肾脏病的发病率约为10.8%,其中每年约有数十万例进展为CRF[6]。现代医学治疗CRF早中期主要针对原发病采取对症治疗,而到中后期则多是利用透析疗法以维持生命,但这些治疗方法存在着诸如费用高昂、感染率高、副作用显著等弊端。中医在改善CRF相关临床症状、预防和治疗并发症发面均突显其优势。寻找有效抗肾纤维化的中药及方剂,探讨其具体作用机制,有助于预防和延缓CRF进展。

慢性肾衰竭多是以瘀血浊毒贯穿病变过程的始终,因此CRF治疗应以逐瘀泄浊为主,通过祛除瘀血浊毒,给邪气以出路,使邪却则正复。桃核承气汤出自张仲景《伤寒论》,该方原主邪热与瘀血互结下焦所致之蓄血证,具有泻下瘀血、祛除浊毒的功效,与CRF病机、临床表现相吻合。尿毒清颗粒是临床上治疗CRF使用较为广泛的中药复合制剂,具有通腑降浊、健脾祛湿、活血化瘀的作用,临床疗效肯定,故将其作为本实验阳性对照药。

本实验研究发现,CRF模型组大鼠精神状态较差,体型较瘦,毛色枯槁,爪、尾色淡,反应迟缓,不喜活动,进食减少,大便质稀,个别大鼠存在“腹水”情况,体质量增长缓慢,甚至出现体质量下降。且病理观察发现肾组织细胞结构不完整,炎性细胞浸润,细胞外基质增多,肾间质纤维化明显,较为符合中医慢性肾衰竭的生物学特征,提示成功建立CRF大鼠模型。

CRF病变机制复杂,其中肾纤维化是其主要病理基础,肾纤维化的发生和持续加重可能涉及到炎症反应和多种细胞因子和分子因素的表达异常,在此基础上导致细胞外基质产生增多及沉积过度是肾纤维化形成的重要分子基础[7]。Wnt/β-catenin信号通路异常激活、传导与肾纤维化的发生关系密切。肾损伤时会激活Wnt通路,引发下游多种肾纤维化相关靶基因的异常表达,从而导致肾单位持续性、不可逆性损伤[8]。β-catenin表达升高是导致肾纤维化的重要因素,当Wnt信号通路异常激活时,游离态的β-catenin会进入细胞核,与核内的TCF/LEF的氨基末端结合,共同参与调控Wnt通路介导的肾纤维化转录[9]。APC作为降解β-catenin的多蛋白复合体的重要组分,通过磷酸化控制β-catenin向细胞核转移,是Wnt信号通路的重要抑制因子[10]。

本实验结果显示,模型组大鼠肾组织中APC的mRNA和蛋白相对空白组和假手术组呈低表达,而β-catenin、TCF4的mRNA和蛋白含量则呈高表达,这与既往相关文献[11]报道结果一致。经灌胃干预后,桃核承气汤组大鼠的一般情况、血常规和肾功能、肾脏病变组织修复方面均较模型组明显改善,且该组APC的mRNA和蛋白表达含量升高,而β-catenin、TCF4表达均下降。因此认为,桃核承气汤可能是通过上调Wnt信号通路中APC的表达、下调β-catenin、TCF4的表达水平,减少细胞外基质的过度生成,抑制肾纤维化进展,从而达到治疗CRF的目的。

综上所述,桃核承气汤治疗CRF的作用机制可能与上调APC表达、下调β-catenin及TCF4的表达以抑制Wnt/βcatenin通路活性,改善贫血状态和肾功能,减轻和修复肾纤维化有关,但其具体调控机制还有待深入研究。