正交试验优选椒桂酊的提取工艺研究

张庆莲,皮凤娟,黄 娟,许 曾,张世波

(泸州市中医医院,四川 泸州646000)

椒桂酊源于《黄帝内经》中的药熨方,由花椒、干姜、肉桂组成,药味均有辛热之性,具有温阳散寒、通脉止痛的功效[1-2],可用于寒邪引起的各种疼痛,如寒痹、肩凝症、心腹寒气痛、跌打损伤、风寒湿痹症、盆腔炎等[3-4]。《黄帝内经》中药熨方的用药方法是连同药渣一起外敷于患处[5],用药过程麻烦,且不利于携带和保存,经查阅文献,目前尚无将药熨方开发为酊剂使用记载。因此,本研究将其开发为医疗机构制剂,经系统研究,制成工艺稳定、使用方便的酊剂。本研究采用正交试验法考察药材粒度、浸出时间和乙醇浓度3个因素,以桂皮醛含量、总固体量两种指标进行综合评价,优选出最佳提取工艺,为椒桂酊的工业化大生产提供参考。

1 材料

1.1 仪器

电子天平(FA2004型,上海安亭电子仪器厂),电子天平(SQP型,北京赛多利斯),电热鼓风干燥箱(GZX-GF101-3-BS-Ⅱ/H型,上海跃进医疗器械有限公司),高效液相色谱仪(Agilent 1260型,美国安捷伦)。

1.2 试药

桂皮醛对照品(纯度99.6%,批号110710-201821,由中国食品药品检验研究院提供);花椒(批号191001131)、干姜(批号190302441)、肉桂(批号181201481),由成都康美药业生产有限公司提供,3种药材经全检,均符合《中华人民共和国药典》2015年版一部项下的有关规定。3种中药饮片经主任中药师张世波鉴定为正品。水采用超纯水,乙腈采用色谱纯,其余试剂采用分析纯。

2 方法及结果

2.1 溶剂用量确定

对处方量药材进行吸醇率考察,按处方比例称取适量药材置于烧杯中,加60%、70%、80%3种浓度乙醇分别浸渍,在浸泡10 min、20 min、30 min、40 min、60 min、90min、120 min、180min、240min、360min、480min时间点测定相应浓度的乙醇体积。以时间(min)为横坐标,吸醇量(m L)为纵坐标,绘制不同加醇浓度在不同时间的吸醇率图谱,见图1。结果显示,120 min后吸醇量增加缓慢并趋于平衡。为保证与传统用药一致,采用传统提取工艺浸渍法进行提取[6]。根据吸醇率考察结果看,120 min后吸醇量基本趋于平衡,此时的量约为药材量的1.5倍。根据《中华人民共和国药典》四部通则“酊剂”项下的要求,100 m L药液相当于20g药材[7],即药液比为1∶5,加上药材吸醇量,根据预试验结果,采用6倍量的溶剂浸渍,吸取上清液加入少量溶剂至规定量即可。

图1 吸醇率

2.2 正交试验设计

经查阅文献[8-10]资料,选择药材粒度(因素A)、浸渍时间(因素B)与乙醇浓度(因素C)作为工艺考察的影响因素,采用4因素3水平正交试验表(即L9(34)正交表)对提取工艺进行考察,以桂皮醛含量及总固体量两种指标为考察指标,综合评分=(桂皮醛含量/桂皮醛含量最大值)×60+(总固体量/总固体量最大值)×40。因素与水平见表1。

表1 因素与水平

2.3 正交试验提取液的制备

称取处方比例的药材,按正交试验设计表1、表6分别加入6倍量溶剂,浸渍一定天数,滤过,定容即得。

2.4 总固体测定

将9个正交试验的浸渍液分别精密量取25 m L于已恒重的蒸发皿中,蒸干,放入105℃电热恒温鼓风干燥箱中烘3 h,取出,置干燥器中冷却30 min,迅速精密称定质量,计算浸出物得率[11],见表6。

2.5 桂皮醛含量测定

2.5.1 对照品溶液制备 精密称取桂皮醛对照品适量,加入乙腈至容量瓶中稀释至刻度,摇匀,制成11.23 mg/m L的对照品母液;再精密量取桂皮醛对照品母液0.5 m L于10 m L容量瓶中,加入乙腈至容量瓶中稀释至刻度,摇匀,制成11.23μg/m L的对照品溶液。

2.5.2 供试品溶液制备 精密量取1 m L药液,放入50 m L容量瓶中,将甲醇加入容量瓶中稀释至刻度,摇匀后,再用0.45μm的微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。

2.5.3 阴性溶液制备 称取缺肉桂的其他药材,加入6倍量溶剂,浸渍,滤过,照供试品溶液的制备方法进行制备,即得阴性溶液。

2.5.4 色谱条件与系统适用性试验 色谱条件为采用ZORBAX SB-C18(5μm,250mm×4.6mm)色谱柱;流动相比例为乙腈-水(35∶65);柱温为30℃;流速为1 m L/min;检测波长为290 nm。将桂皮醛对照品溶液、缺肉桂阴性溶液、椒桂酊供试品溶液,分别注入10μL于高效液相色谱液中测定峰面积,结果阴性无干扰。见图2。

图2 桂皮醛对照品、椒桂酊供试品、缺肉桂阴性溶液色谱

2.5.5 线性关系考察 精密量取已配制好的桂皮醛对照品母液0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.2 m L,分别置于容量瓶中,加入色谱乙腈稀释并定容至10 mL,根据“2.5.4”项下色谱条件,分别注入10μL于高效液相色谱仪中进行峰面积测定,以进样量X(μg)为横坐标,峰面积Y为纵坐标,计算回归方程,结果为Y=182.52X+28.222(r=1),说明桂皮醛在1.123~16.845μg范围内线性关系较好。

2.5.6 精密度考察 精密量取桂皮醛对照品溶液,根据“2.5.4”项下色谱条件,分别注入10μL于高效液相色谱仪中进行峰面积测定,重复进样6次,结果RSD为0.42%,说明仪器精密度较好。见表2。

表2 精密度试验

2.5.7 重复性考察 取同一批次药液6份,按“2.5.2”项下供试品溶液制备方法制备样品,根据“2.5.4”项下色谱条件,分别注入10μL于高效液相色谱仪中进行峰面积测定,结果RSD为1.52%,说明重现性较好。见表3。

表3 重复性试验

2.5.8 稳定性考察 取同一供试品溶液,按“2.5.4”项下色谱条件,分别于不同时间点(0、2、4、6、8h)注入10μL于高效液相色谱仪中进行峰面积测定,结果RSD为0.83%,说明供试品溶液在8 h内稳定。见表4。

表4 稳定性试验

2.5.9 加样回收率试验 精密量取6份已知桂皮醛含量的样品0.5 m L,分别加入桂皮醛对照品溶液,使其加入量相当于样品中桂皮醛含量的50%,按“2.5.2”项下方法处理样品溶液,按“2.5.4”项下色谱条件测定含量,计算回收率。结果平均回收率为100.71%,RSD为1.06%(n=6),表明方法准确度良好。见表5。

表5 回收率试验

2.6 正交结果

采用两种指标综合评分,其中总固体量占40%,桂皮醛含量占60%,结果见表6、表7。

表6 L9(34)正交试验结果

表7 方差分析结果

根据表6、表7分析结果,因素A(药材粒度)P<0.01对综合评分结果有显著性影响,因素B(浸渍时间)P>0.05、因素C(乙醇浓度)P>0.05对综合评分结果无显著性影响。根据表6中R值比较,影响因素大小为A>B>C。其中,因素A中K1>K2>K3,因素B中K3>K2>K1,因素C中K2>K3>K1,因此,优选出的最佳工艺为A1B3C2,即药材粒度为饮片,加6倍量70%乙醇,浸渍14 d。

2.7 验证试验

根据正交试验优选的最佳工艺A1B3C2进行提取,做3个验证试验,测定桂皮醛含量及总固体量。结果桂皮醛平均含量为10.32 mg/g,RSD为2.93%,总固体平均含量为11.96%,RSD为0.19%,说明优选的工艺稳定可行。

3 讨论

(1)试验过程中桂皮醛对照品采用2015年版《中华人民共和国药典》中的制备方法,加入甲醇溶解,结果发现,桂皮醛在甲醇中不稳定。经查阅文献[12]显示,桂皮醛在甲醇中不稳定,但在乙腈及乙酸乙酯中稳定,因此含量测定中桂皮醛对照品溶液的配制采用乙腈溶解。

(2)由于中药复方制剂药味组成多,成分比较复杂,且两种指标或多种指标加权评分可更好地控制中药制剂的质量。本研究中君药花椒在2015年版《中华人民共和国药典》标准中无含量测定方法,臣药干姜的有效成分6-姜辣素,预实验采用多种流动相及制样方法测定,阴性均有干扰。因此,椒桂酊的提取工艺研究采用桂皮醛含量及总固体量两种指标进行综合评价。最终优选出最佳提取工艺为加6倍量的70%乙醇浸渍14d,通过验证试验亦证明了工艺稳定可行,因此,本研究可为椒桂酊规模生产提供参考。