结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术在脊柱结核检测中的应用

王新刚，卫建民，杨俊松，王自立，冯万立，夏斌，吕会强

(宝鸡市中医医院脊柱骨病二科，陕西宝鸡 721001)

脊柱结核约占所有结核病患者的1%～3%、骨关节结核的50%，是导致脊柱畸形甚至截瘫的主要原因[1]。抗结核化疗是治疗脊柱结核的基础，早期诊断和确定结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)的药物敏感性有助于降低初治失败和局部结核复发的风险[2]。基于分枝杆菌液体培养系统的表型药敏试验(phenotypic susceptibility test,pDST)和应用Lo-westein-Jensen(LJ)培养基的绝对浓度法是诊断耐药结核(drug-resistant tuberculosis,DR-TB)的传统方式，但存在诊断时间长的缺点，易延误脊柱结核治疗，进一步导致获得性耐药[3]。结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(GeneXpert Mycobacterium tuberculosis/Rifampin,Xpert MTB/RIF)是基于MTB核酸扩增的自动化分子检测方法，检测过程仅需2 h，可同时检测利福平耐药MTB中的MTB特异核酸和rpoB基因突变，世界卫生组织建议将其作为结核病快速诊断的方法[4]。近年来国内外学者尝试将Xpert MTB/RIF技术用于骨关节结核的诊断和治疗，结果表明，利福平-DR试验具有较高的敏感性和特异性，但MTB试验敏感性中等[5-6]。鉴于脊柱结核临床标本异质性高、细菌数量少、需要积极行术前抗结核治疗等特点，可能会降低诊断敏感性，因此，本研究通过比较不同脊柱病变组织标本的细菌培养、pDST、Xpert MTB/RIF阳性率，旨在为脊柱结核的临床诊断提供参考，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年1月～2019年8月在本院就诊的127例脊柱结核患者，纳入手术切除的脓液108份，干酪样组织94份，肉芽组织99份，共计301份标本。将病变硬块组织彻底粉碎后，在3000转/min条件下离心20 min，取沉淀物分作2份，储存于-80℃，一部分用于细菌培养和pDST，另一份用来进行Xpert MTB/RIF检测。

1.2 表型药敏试验

使用BACTEC MGIT 960分歧杆菌液体培养系统和LJ培养基绝对浓度法分别培养分枝杆菌对阳性标本进行培养鉴定，以LJ绝对浓度法测定11种抗结核药物的pDST。11种药物的临界浓度分别为异烟肼(1,10 mg/mL)、利福平(50,250 mg/mL)、链霉素(0,100 mg/L)、乙胺丁醇(5,50 mg/mL)、左氧氟沙星(5,50 mg/mL)、4-氨基水杨酸(1,10 mg/mL)、丙硫异烟胺(25,100 mg/mL)、帕西尼嗪(0.1,1 mg/mL)、利福喷丁(50,250 mg/mL)、阿米卡星(10,100 mg/mL)、卷曲霉素(10,100 mg/mL)。

1.3 Xpert-MTB/RIF分析

根据Xpert MTB/RIF操作说明，收集500 μL沉淀物添加到1.5 mL试样液体中，混合后在室温下孵育15 min，添加到样品箱中，然后将样品箱加入4通道基因Xpert平台中进行自动操作，约2 h即可在检测软件窗口直接读取结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0软件包进行数据分析，计数资料采用率或百分比表示，采用x2检验，以培养物和pDST为金标准，计算同一标本细菌培养和Xpert-MTB/RIF检测的敏感度，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

脓液、干酪样和肉芽组织细菌培养阳性患者60例，阳性率47.24%。其中，脓液阳性56例，干酪样阳性47例，肉芽组织阳性35例；共301份标本中，培养阳性138份，阳性率45.85%。脓液标本和干酪样标本的培养阳性率均显著高于肉芽组织(P<0.05)。

Xpert MTB/RIF检测脓液、干酪样标本和总标本阳性率均显著高于细菌培养(P<0.05)；两种方法检测脓液、干酪样标本的阳性率均高于肉芽组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。60例细菌培养阳性的患者中，58例利用Xpert MTB/RIF法检测阳性，敏感度为96.67%；67例细菌培养阴性的患者，36例Xpert MTB/RIF法检测阳性，敏感度为53.73%，见表2。

表1 不同组织培养阳性率比较

表2 Xpert MTB/RIF检测MTB的敏感性

60例细菌培养阳性的患者中，利福平耐药27例(45%)，Xpert MTB/RIF检测MTB均阳性，Xpert MTB/RIF检测利福平耐药26例，敏感度为96.30%；33例细菌培养非利福平耐药者中，有2例Xpert MTB/RIF检测MTB阴性，剩余31例细菌培养非利福平耐药者中Xpert MTB/RIF检测利福平耐药2例，特异性为93.54%。 见表3。

表3 Xpert MTB/RIF检测利福平DR的敏感性和特异性

3 讨论

脊柱耐药结核很难治愈，易复发，需要长期个体化化疗、早期诊断和药敏试验(drug sensitivity test，DST)，才能达到有效的疾病维持。既往研究中，通常需数周时间才能完成细菌培养和DST，阳性率为10%～60%，此期间不当的抗结核化疗可导致获得性耐药和局部复发[7]。与痰标本相比较，脊柱结核临床标本异质性高、细菌计数少、标本预处理要求高、采集难度大、针吸活检采集标本困难，基因芯片、线性探针等分子诊断技术虽然可提高敏感度，但加重患者经济负担，而且操作复杂，对实验室环境和技术人员要求较高。因此，开发简便、高效、准确的脊柱结核诊断方法和耐药性诊断方法具有重要意义[8]。

基于PCR的分子诊断是结核病和耐药性有效的诊断方法，自2010年世界卫生组织建议使用Xpert MTB/RIF快速检测以来，得到了较大范围的推广应用[9]。既往研究显示，Xpert MTB/RIF法对骨关节结核检查的敏感性为63.57%～95.60%，特异性为96.20%～100.00%，Xpert MTB/RIF法对利福平耐药的敏感性为93.33%～100%，特异性为94.12%～100%[10-11]。Xpert MTB/RIF检测最大程度简化了MTB的检测，操作简单、检测结果可靠，灵敏度和特异性高[12]。本研究对符合NICE2011骨关节结核临床诊断标准的脊柱结核患者，采集其脓液、干酪坏死组织和肉芽组织，制备不同类型的标本，结果显示，Xpert MTB/RIF法检测MTB的总阳性率显著高于细菌培养，对脓液和干酪样标本检查的阳性率均显著高于细菌培养，而以细菌培养和pDST为金标准检测的敏感度为96.67%，敏感度较高。这些结果提示，Xpert MTB/RIF法对脊柱结核标本，尤其是对脓液和干酪样标本的敏感性高于细菌培养法。

Xpert MTB/RIF分析依赖于标本中的MTB-DNA含量，而BACTEC-MGIT-960培养依赖于活菌计数。Dong等[13]对50例经病理证实的脊柱和关节结核患者术后经BACTEC-MGIT-960培养的标本检测中，死骨阳性率为41.9%，脓液阳性率为40.0%，肉芽组织阳性率为33.3%，提示不同类型组织标本活菌数存在差异。Li等[14]对43例经病理证实患有晚期关节结核的患者进行研究，该研究收集43份术后标本，进行了基于PCR的荧光检测，肉芽组织阳性率为74.42%，高于干酪样组织的58.14%和脓液的37.21%，结果提示不同组织间MTB-DNA含量存在差异。目前对脊柱结核不同组织标本检测的差异较少见报道，本研究结果显示，在Xpert MTB/RIF法和细菌培养法中，脓液阳性率均高于肉芽组织和干酪样组织，结果提示临床穿刺收集脓液有利于早期病菌的检测。

综上所述，Xpert MTB/RIF在脊柱结核标本检验中有较高的敏感性，收集脊柱结核患者的各种标本尤其是脓液标本，使用Xpert MTB/RIF可方便、快速、准确地诊断结核感染和DR，值得临床推广应用。