lncRNA NCRNA00173靶向miR-765对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响的实验研究

吴昌强，韦 敏，郑一鸣，林正坚

（海南省海口市第三人民医院骨科，海口 571100）

骨肉瘤（osteosarcoma）是儿童和青少年中发病率最高的恶性骨肿瘤，临床上定位于长骨的干骺端。骨肉瘤常见于早期转移和肺转移，是导致骨肉瘤患者死亡的主要原因[1]。尽管数十年来研究者付出了很多努力，但骨肉瘤患者的五年生存率仍然不能令人满意。由于骨肉瘤的早期症状是非特异性的，且治疗有限[2]。因此，确定骨肉瘤的新诊断标志物和治疗靶标至关重要。长非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类长度超过200 个核苷酸的非编码RNA分子，在多种生物学过程中具有重要功能，例如淋巴结的转移、细胞凋亡和细胞周期控制、细胞发育和分化、转录和翻译调控以及中枢代谢[3-5]。越来越多的证据证实，lncRNA 的表达失调通常与人类许多疾病有关，包括骨肉瘤在内的多种类型的癌症[6-7]。最近，发现一种新的lncRNA NCRNA00173 在肝癌中表达失调[8]。徐绘华等[9]通过lncRNA 芯片及实验发现，NCRNA00173 在骨肉瘤组织中表达下调，且其低表达与肿瘤分化、远处转移以及疾病分期密切相关。然而，NCRNA00173在骨肉瘤中的作用及潜在的分子机制知之甚少。本项研究旨在探讨lncRNA NCRNA00173对骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭的影响，并探究其可能的作用机制，以期为骨肉瘤的靶向治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 骨肉瘤细胞株U2-OS、Saos-2、SJSA-1 和SOSP-9607 购于美国ATCC；人成骨细胞hFOB1.19 购于中国科学院上海细胞库；DMEM培养基购于美国Gibco；脂质体Lipofectamine 2000转染试剂购于美国Invitrogen；胎牛血清和胰蛋白酶购于美国HyClone；总RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR（qPCR)检测试剂盒购于赛默飞世尔科技有限公司；miR-765 mimics及mimics control购于广州市锐博生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Promega；含miR-765结合位点NCRNA00173野生型荧光素酶重组报告质粒（NCRNA00173-Wt）和含miR-765 结合位点NCRNA00173 突变型荧光素酶重组报告质粒（NCRNA00173-Mut）购于上海吉玛制药技术有限公司；实验所用引物、pcDNA3.1 载体和pcDNANCRNA00173 重组载体质粒购于上海生工生物工程有限公司；Transwell 小室购于美国Coming Costar；Matrigel 基质胶购于BD Biosciences；增殖细胞核抗原（PCNA）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）单克隆抗体和二抗购于美国CST；ECL化学发光试剂、细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购于赛默飞世尔。

1.2 细胞培养 将骨肉瘤细胞U2-OS、Saos-2、SJSA-1、SOSP-9607 和人成骨细胞hFOB1.19 置于含5%CO2、37 ℃恒温培养箱中，并采用含10%胎牛血清、100 U/mL 青－链霉素的DMEM 培养基进行培养。使用显微镜及时观察细胞生长情况，每隔1 d更换1 次培养液，待细胞达85%汇合时进行传代培养。

1.3 细胞转染 对数生长期的U2-OS 细胞种植于6孔板中，于37 ℃恒温培养箱过夜培养，待细胞生长融合度至60%左右时，使用Lipofectamine 2000转染试剂将pcDNA-NCRNA00173质粒或空载质粒转染至U2-OS细胞，具体操作参照转染试剂说明书。其中转染pcDNA-NCRNA00173 质粒的细胞作为NCRNA00173组，转染空载质粒的细胞作为pcDNA组，未行转染的细胞作为空白对照即Con 组。转染后各组U2-OS 细胞于37 ℃培养箱持续培养48 h，收集各组细胞进行后续相关指标检测。

1.4 qPCR 实验检测细胞中NCRNA00173 和miR-765 的表达 使用总RNA 提取试剂盒分别提取待测细胞中总RNA，测定RNA 的浓度，选取合格的RNA 利用逆转录试剂盒将RNA 逆转录成cDNA。采用cDNA 为模板，以GAPDH 和U6 为内参，使用qPCR 检测试剂盒分别检测NCRNA00173 和miR-765的相对表达量，扩增条件为：95 ℃预变性5 min；设40个循环，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。实验数据采用2-ΔΔCt法计算。实验所需引物如下：NCRNA00173，F：5’-ACCTAGTCTTCCTTGGCACATC-3’，R：5’-GGGATATTGATCTGAAGGGTGA-3’。GAPDH，F：5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’，R：5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’；miR-765，F：5’-GCCTGGAGGAGAAGGAA-3’，R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6，F：5’-CGCTAGCACATATCGGCTA-3’，R：5’-TTCTGCGACGAATTTGTCAT-3’。

1.5 双荧光素酶报告实验检测NCRNA00173 和miR-765的靶向关系 对数期的U2-OS细胞种植到6 孔板上，于37 ℃恒温培养箱培养，待细胞贴壁后，将NCRNA00173-Wt 和NCRNA00173-Mut 荧光素酶重组载体质粒分别和miR-765 mimics 或mimics control共转染U2-OS细胞，具体转染步骤参照Lipofectamine 2000转染试剂使用说明，转染后的U2-OS细胞37 ℃恒温培养箱继续培养48 h 后，收集细胞，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定细胞的相对荧光素酶活性。

1.6 噻唑蓝（MTT）实验检测细胞增殖能力 U2-OS 细胞以3×103个/孔种植于96 孔板上，于37 ℃恒温培养箱培养，待细胞贴壁后进行转染（参考上述1.3项），分别在转染24 h、48 h和72 h时向每孔细胞中添加100 μL MTT 溶液，37 ℃恒温培养箱继续孵育4 h，去上清培养液，再向每孔细胞中添加150 μL二甲基亚砜，待沉淀完全溶解后，使用酶标仪在450 nm 波长处测定每孔细胞的吸光度（OD）值，以OD值反映细胞增殖能力。

1.7 克隆形成实验检测细胞克隆形成能力 U2-OS 细胞按照上述1.3 分组处理，24 h 后以胰蛋白酶消化各组U2-OS 细胞，收集并计数，向每个培养皿中接种300 个细胞，于37 ℃培养箱培养，换液1 次/3 d，培养约2周后出现细胞克隆（肉眼可见）时终止培养，以PBS洗涤2次，采用4%多聚甲醛染色20 min，GIMSA染色液染10 min，观察并计数各组U2-OS细胞克隆形成数（＞50 个细胞克隆记为1 个细胞克隆）。

1.8 划痕实验检测细胞迁移能力 U2-OS 细胞按照上述1.3 项分组处理24 h 后，以胰蛋白酶消化各组U2-OS细胞，以3×105个/孔接种到6孔板（背面画有直线）中，待细胞铺满底部时，使用枪头垂直6 孔板背面直线进行划线，以PBS洗涤3次，再加入培养液2 mL，拍照，此时记为0 h，将6 孔板放置在37 ℃培养箱培养24 h，拍照此时记为24 h，采用Image J软件计算U2-OS细胞划痕愈合率。

1.9 Transwell 实验检测细胞侵袭和迁移能力 以0.25%胰蛋白酶消化并收集转染48 h后各组U2-OS细胞，以PBS洗涤3次，使用不含血清的培养液悬浮细胞，调整细胞密度至5×105/mL。在Transwell小室的下室加入含10%胎牛血清的培养液500 μL，在上室（小室的上室未以Matrigel 基质胶包被的为细胞迁移实验，上室以Matrigel 胶包被的为细胞侵袭实验）加入200 μL 细胞悬液，将小室放置在37 ℃恒温培养箱继续培养48 h，取出Transwell 小室，用干净的棉签拭去上室未穿过膜的细胞，用多聚甲醛固定，随后使用0.1%的结晶紫染色10 min，使用倒置显微镜随机选取6 个视野拍照并计数，以穿膜细胞数反映U2-OS细胞的迁移或侵袭能力。

1.10 蛋白质印迹（Western blotting）实验检测细胞中PCNA、MMP-2和MMP-9的表达 以0.25%胰蛋白酶消化并收集转染48 h后各组U2-OS细胞，以适量RIPA裂解液在冰上裂解细胞，抽提总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，制备SDS-PAGE，行电泳分离蛋白，使用半干法将蛋白电转至PVDF 膜上，在5%脱脂奶粉中封闭2 h，将膜放置在含一抗的溶液中进行杂交，其中PCNA、MMP-2和MMP-9一抗均为1∶500稀释，4 ℃冰箱摇床孵育过夜，洗膜后将膜放置1∶3 000稀释的二抗溶液中，室温孵育2 h，通过ECL发光显影，采集图像，分析各条带灰度值，分别计算细胞中PCNA、MMP-2和MMP-9的表达水平。

1.11 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计软件分析实验数据，以上实验至少重复3 次，计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NCRNA00173 和miR-765 在骨肉瘤细胞中的表达 与成骨细胞hFOB1.19 相比，骨肉瘤细胞株U2-OS、Saos-2、SJSA-1 和SOSP-9607 中NCRNA 00173 的表达明显下调（P＜0.05），而miR-765 的表达明显上调（P＜0.05），见表1。由于NCRNA00173在U2-OS 细胞中下调最明显，因此后续实验以U2-OS细胞为实验细胞株。

表1 NCRNA00173和miR-765在各细胞株中的表达水平比较

表1 NCRNA00173和miR-765在各细胞株中的表达水平比较

与hFOB1.19细胞比较，*P＜0.05。

2.2 检测NCRNA00173 过表达转染效果 与Con组和pcDNA 组比较，NCRNA00173 组U2-OS 细胞中NCRNA00173 的表达水平显著升高（P＜0.05）；与Con组相比，pcDNA组中NCRNA00173的表达水平无明显改变（P＞0.05），见表2。

表2 各组U2-OS 细胞中NCRNA00173 和miR-765 表达水平比较

表2 各组U2-OS 细胞中NCRNA00173 和miR-765 表达水平比较

与Con组比较，*P＜0.05；与pcDNA组比较，&P＜0.05。

2.3 NCRNA00173 和miR-765 靶向关系验证 生物信息学软件Starbase 预测结果发现，NCRNA 00173和miR-765间具有特异性互补结合位点；双荧光素酶报告基因实验结果发现，与miR-NC组相比，miR-765 组NCRNA00173-Wt 细胞的相对荧光素酶活性显著降低（P＜0.05），而NCRNA00173-Mut 细胞的相对荧光素酶活性无显著变化（P＞0.05），见图1和表3。

表3 双荧光素酶报告基因实验检测细胞的相对荧光素酶活性

表3 双荧光素酶报告基因实验检测细胞的相对荧光素酶活性

与miR-NC组比较，*P＜0.05。

图1 生物信息学预测NCRNA00173 和miR-765 的结合位点示意图

2.4 过表达NCRNA00173 对U2-OS 细胞增殖的影响 与Con 组和pcDNA 组相比，NCRNA00173 组U2-OS 细胞OD 值从48 h 开始显著降低（P＜0.05），克隆形成细胞数明显减少（P＜0.05）；与Con 组相比，pcDNA组克隆形成细胞数及细胞OD值在24 h、48 h 和72 h 时均无明显改变（P＞0.05），见表4 和图2。

表4 各组U2-OS细胞增殖能力（OD值）和克隆形成能力比较

表4 各组U2-OS细胞增殖能力（OD值）和克隆形成能力比较

与Con组比较，*P＜0.05；与pcDNA组比较，&P＜0.05。

图2 克隆形成实验检测24 h各组U2-OS细胞克隆形成能力

2.5 过表达NCRNA00173 对U2-OS 细胞迁移和侵袭的影响 与Con 组和pcDNA 组相比，NCRNA 00173组U2-OS细胞迁移和侵袭数均显著减少（P＜0.05），划痕愈合率明显降低（P＜0.05）；与Con 组相比，pcDNA组划痕愈合率迁移和侵袭细胞数均无明显改变（P＞0.05），见图3和表5。

图3 各组细胞迁移和侵袭能力

表5 各组U2-OS细胞迁移和侵袭细胞数比较

表5 各组U2-OS细胞迁移和侵袭细胞数比较

与Con组比较，*P＜0.05；与pcDNA组比较，&P＜0.05。

2.5 过表达NCRNA00173对U2-OS细胞中PCNA、MMP-2和MMP-9表达的影响 与Con组和pcDNA组相 比，NCRNA00173 组U2-OS 细胞中PCNA、MMP-2 和MMP-9 的表达水平均显著降低（P＜0.05）；与Con 组相比，pcDNA 组PCNA、MMP-2 和MMP-9的表达均无明显改变（P＞0.05），见图4和表6。

图4 各组U2-OS细胞中PCNA、MMP-2和MMP-9的表达

表6 各组U2-OS 细胞中PCNA、MMP-2 和MMP-9 的表达水平比较

表6 各组U2-OS 细胞中PCNA、MMP-2 和MMP-9 的表达水平比较

与Con组比较，*P＜0.05；与pcDNA组比较，&P＜0.05。

3 讨论

越来越多的研究表明，lncRNA 在调节癌症生长和迁移中起着关键作用，这增加了我们对几种疾病，尤其是恶性肿瘤的生物学行为的了解[10-11]。先前的证据表明lncRNA是包括骨肉瘤在内的多种肿瘤治疗靶标和有价值的生物标志物。例如，lncRNA CBR3-AS1 在调节骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡中起着致癌作用，并且是骨肉瘤患者的一个独立的不良预后因素[12]。lncRNA HIF2PUT 的过表达通过下调HIF-2α 抑制骨肉瘤干细胞的球形形成，并且显著抑制了骨肉瘤干细胞的增殖、迁移和侵袭能力，这些发现表明，lncRNA HIF2PUT可能是治疗骨肉瘤的新靶点[13]。lncRNA HIF1A-AS2 在骨肉瘤中表达上调，且其过表达可通过调节miR-129-5p促进骨肉瘤细胞的增殖、细胞周期进程和侵袭，这些结果表明，HIF1A-AS2 可能是骨肉瘤的潜在治疗靶标[14]。NCRNA00173 作为一种新的lncRNA，在肝癌中表达下调，提示包括NCRNA00173在内的lncRNA 可能提供新颖的分子生物标志物，并为对抗肝癌病例的转移提供新的基础[8]。近期研究显示，NCRNA00173 在骨肉瘤组织中表达下调，且与患者的肿瘤分期、远处转移等密切相关[9]。但是，骨肉瘤和NCRNA00173之间的关系尚未见相关报道。本实验首次对NCRNA00173 在骨肉瘤中的功能进行了探究。本研究中首先检测了NCRNA 00173在骨肉瘤细胞中的表达情况，结果显示，与成骨细胞hFOB1.19 相比，骨肉瘤细胞中NCRNA 00173的表达下调（P＜0.05），提示NCRNA00173在骨肉瘤中可能发挥调控作用。

先前的研究表明，lncRNA 通过充当miRNA 的“海绵”而在调节生物细胞过程中发挥关键作用[15-16]。为探究NCRNA00173在骨肉瘤细胞中的功能，本研究初步证实NCRNA00173可靶向结合miR-765。已发现miR-765 在人类某些癌症中具有不同的作用。miR-765对舌鳞状细胞癌的细胞增殖和侵袭具有抑制作用[17]。相反，miR-765 通过抑制人肝癌中的INPP4B促进细胞增殖[18]。近期Lv等[19]研究显示，miR-765 的表达在骨肉瘤组织中显著增加，miR-765 的上调促进了骨肉瘤中的细胞增殖、迁移和侵袭。Linc00511 过表达通过下调miR-765 促进了骨肉瘤MG-63 细胞的增殖、集落形成和迁移[20]。本研究中观察到miR-765在骨肉瘤细胞中表达上调（P＜0.05），提示NCRNA00173 可能通过负向调控miR-765的表达而参与骨肉瘤发生及发展过程。

随后本实验进一步研究了其在骨肉瘤细胞系中的功能。功能实验显示，外源性高表达NCRNA 00173 抑制了骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭（P＜0.05）。此外，本研究结果显示，过表达NCRNA 00173 能够有效抑制增殖相关蛋白PCNA 的表达（P＜0.05）。PCNA 参与DNA 代谢的各种过程，包括DNA复制和修复，染色质组织和转录以及姐妹染色单体凝聚。另外，PCNA参与细胞存活，是细胞处于增殖状态的标志分子。MMP-2和MMP-9参与正常生理过程以及疾病过程（例如癌症转移）中细胞外基质的分解。本研究结果发现，过表达NCRNA 00173抑制MMP-2和MMP-9的表达（P＜0.05）。以上这些结果提示，过表达NCRNA00173可能通过抑制PCNA、MMP-2 和MMP-9 的表达阻碍骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。在临床环境中，抑制NCRNA00173 表达可能是治愈骨肉瘤的一种治疗策略。但需要更多的研究来解释NCRNA 00173 在骨肉瘤发展中的分子机制。

综上，下调表达的NCRNA00173在骨肉瘤中起抑癌基因的作用，并通过调节miR-765 的表达抑制骨肉瘤的发生，这表明NCRNA00173可能是骨肉瘤的潜在治疗靶点。