六月青醇提物凝胶剂对大鼠慢性湿疹的作用研究*

陈红丽，巫小媚，万杰青，劳永洁，胡晓凡，黄建春

（广西医科大学药学院，南宁 530021）

湿疹是一种多发于免疫力低下群体的皮肤炎症性疾病，主要表现为皮损和瘙痒反复发作，严重影响疾患人群的身体和心理健康。研究发现，免疫功能紊乱是导致湿疹发生的重要因素[1]，可表现为细胞免疫和体液免疫的失衡。因此，探寻改善湿疹免疫失衡的方法成为治疗该疾病的重要策略。六月青是一种广西民间草药，系爵床科植物肖鸡笼[Tarphochlamys affinis(Griff.) Bremekhu]的地上干燥部分[2]，《本草拾遗》记载六月青具有消肿、解毒、舒肝泻湿及行血散瘀等作用。现代研究发现，六月青可促进脾淋巴细胞IFN-γ 分泌，改善脾淋巴细胞转化功能和巨噬细胞吞噬功能[3-4]，并在免疫调节、杀菌、抗溃疡、减轻炎症、降低角质化程度、软化瘢痕和抑制湿疹等方面具有一定的功效[5-10]。鉴于六月青在改善免疫机能方面的功效，结合湿疹的病因，六月青很可能成为治疗湿疹的候选药物。本研究采用课题组前期制备的六月青凝胶剂治疗湿疹模型大鼠，通过观察皮损、皮肤病理和免疫平衡的变化，探索六月青凝胶剂对慢性湿疹的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级SD 大鼠38 只，体重（150 ±20）g，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK 桂2014-0002，实验动物使用许可证号：SYXK桂2014-0003。

1.2 药物与试剂 六月青醇提物凝胶剂由广西医科大学药学院实验室制备，制备方法：六月青干燥茎叶用乙醇回流提取法提取得到六月青醇提物浸膏，再分别按照处方量加入甘油、卡波姆和吐温-80，充分混匀，充分膨胀后再用适量三乙醇胺调节pH至7 左右即得。糠酸莫米松凝胶（华润三九药业有限公司，批号：1907003J）；2，4-二硝基氯苯（DNCB，成都爱科达化学试剂有限公司，批号：201906281）。白细胞介素-4（IL-4）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20191217）；干扰素-γ（IFN-γ）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20191217）。

1.3 湿疹模型的建立 将38只大鼠随机分为空白组（6 只）和模型组（32 只），在模型组大鼠背部皮肤A 处（2 cm×2 cm)和B 处（4 cm×4 cm）脱毛。24 h后，量取100 μL 7%2，4-二硝基氯苯丙酮溶液在大鼠皮肤A 处致敏，不久可观察到大鼠剧烈瘙痒，多次出现打滚、搔抓行为。5 d后，量取200 μL 0.7%二硝基氯苯丙酮溶液在皮肤B 处激发。每隔3 d 激发1次，累计激发8次，B处皮肤渐渐可观察到红斑、豆疹、抓痕、脱屑等现象，对每次激发后皮损情况进行评分和分析[11]。空白组只在A、B两处脱毛，不做其他处理。

1.4 分组及给药 激发结束后，随机选取2只模型组大鼠，处死，取B 处皮肤进行苏木精—伊红（HE）染色并观察组织病理变化，发现表皮增厚粗糙，角化过度，炎细胞浸润的湿疹病理即显示造模成功，再将成模大鼠随机分为5 组：模型组、阳性组、六月青醇提物凝胶剂高、中、低剂量组，每组6 只。停止激发的第2 天，分别于大鼠B 处皮肤涂抹给予相应药物。模型组每只涂抹空白凝胶0.5 g，阳性组每只涂抹糠酸莫米松凝胶0.2 g，六月青醇提物凝胶剂高、中、低剂量组分别每只涂1.5 g、1.0 g、0.5 g，2次/d，连续给药10 d。空白组不做处理。

1.5 皮损评分 每次给药前、后观察造模处皮肤状况，以红斑程度、水肿或丘疹、表皮剥脱或抓痕程度、伤口有无渗出或渗出后结痂程度、角质层苔藓样变程度进行皮损评分。0分为无症状，3分为上述症状十分明显，分值以0.5为单位增加[12]。

1.6 皮肤组织病理学观察 最后1次给药24 h后，麻醉大鼠，腹主动脉采血，采血结束后，取B处皮肤组织用4%甲醛固定，行HE 染色，显微镜下观察皮肤组织病理学变化。

1.7 血清IL-4、IFN-γ含量和IFN-γ/IL-4的检测

取大鼠血液进行离心，取上层血清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清中IL-4 和IFN-γ含量。

1.8 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠皮损评分结果 给药前，5组均有红斑、丘疹、抓痕/剥脱的现象出现，皮损评分比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，阳性组皮损评分在第2 天后下降（P＜0.05），六月青醇提物凝胶高剂量组皮损评分在第4 天后下降（P＜0.05）；与模型组比较，六月青醇提物凝胶中、低剂量组皮损评分在第8天后降低（P＜0.05），见图1、表1。

表1 六月青醇提物凝胶剂对皮损评分的影响 分，，n=6

表1 六月青醇提物凝胶剂对皮损评分的影响 分，，n=6

与模型组比较，*P＜0.05。

图1 六月青醇提物凝胶对皮损的影响

2.2 组织病理学观察 HE 染色结果显示，空白组大鼠皮肤角质层正常，无水肿，无炎性细胞浸润等病理改变。模型组大鼠皮肤出现表皮增厚粗糙、角化过度、炎性细胞浸润的湿疹病理表现。各组采用相应的药物治疗10 d 后，阳性组、六月青醇提物凝胶高、中、低剂量组动物表皮层比较较薄，角化程度较轻，湿疹病理表现明显好转，见图2。

图2 六月青醇提物凝胶组的皮肤组织病理图片（HE染色，×400）

2.3 6组血清中IL-4、IFN-γ含量和IFN-γ/IL-4比较 与空白组比较，模型组IL-4 显著升高（P＜0.05），IFN-γ 及IFN-γ/ IL-4 显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性组的IL-4 显著降低（P＜0.05），IFN-γ 及IFN-γ/IL-4 显著升高（P＜0.05），六月青醇提物凝胶剂高、中、低剂量组大鼠IL-4 无明显变化（P＞0.05），而IFN-γ 及IFN-γ/ IL-4 显著升高（P＜0.05），见表2。

表2 6组大鼠血清IFN-γ、IL-4含量和IFN-γ/IL-4比较 ，n=6

表2 6组大鼠血清IFN-γ、IL-4含量和IFN-γ/IL-4比较 ，n=6

与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

3 讨论

湿疹是临床常见表皮及真皮浅层的炎症性皮肤科疾病，世界范围内有数百万人患有或曾经患有湿疹，湿疹不仅影响患者身心健康，且增加医疗负担。湿疹的发病机制较为复杂，目前尚无特效治疗药物。在湿疹发生的早期阶段，临床表现为红斑、丘疹和小水泡等，严重时出现渗出或者糜烂。组织病理学多表现为皮肤的表皮、真皮结构的破坏。目前，认为皮肤屏障功能障碍是湿疹发病的关键[13]。因此，抑制湿疹早期阶段表皮炎症反应的发生以及保护皮肤的屏障功能至关重要。中药六月青富含皂苷类成分，具有抗炎以及促进表皮细胞生长等药理活性，为验证其对湿疹的疗效，本研究通过用2，4-二硝基氯苯对大鼠进行湿疹造模，经六月青醇提物凝胶涂抹给药10 d 后，发现皮肤红斑改善明显。此外，湿疹模型大鼠皮肤切片显示炎性细胞程弥漫状浸润、细胞有水肿等现象，经六月青醇提物凝胶剂治疗后，大鼠炎性细胞浸润和细胞间水肿的现象减轻，皮肤角质层显著改善。提示六月青醇提物凝胶剂可通过改善湿疹早期皮肤表皮炎症的发生，保护皮肤的屏障功能，减缓湿疹的病情发展。

湿疹是由内外致敏因子引起的疾病，致敏T 细胞激活Th2免疫应答，释放IFN-γ、IL-4等炎症因子，造成组织损伤。在湿疹病理过程中IFN-γ和IL-4的含量水平能反映这两个Th1、Th2 细胞免疫应答参与程度，IFN-γ 和IL-4 在免疫应答中相互调节形成动态平衡[14-15]。本研究结果显示，湿疹模型组大鼠IL-4 升高、IFN-γ 降低，IFN-γ/IL-4 比值降低，出现Th1/Th2 失衡。给予六月青醇提物凝胶剂治疗后，六月青醇提物胶剂高、中、低量组IFN-γ 和IFN-γ/IL-4 比值较模型组显著增大，六月青醇提物凝胶剂中剂量组在均值水平上增加IFN-γ的效果优于高剂量组，可能由于涂抹过厚，不易于经皮吸收，六月青醇提物凝胶剂的剂量和效应关系还需深入研究。但从治疗效果来看，高、中、低剂量均可显著矫正湿疹模型大鼠Th1/Th2的失衡。从湿疹发病的细胞分子机制来看，六月青醇提物可通过改善机体免疫失衡，上调IFN-γ的表达，其机制可能是六月青醇提物在Th0 细胞分化过程中影响细胞因子的分泌，促进Th0向Th1细胞分化，增强IFN-γ的分泌，而减弱IL-4的表达。提示六月青醇提物凝胶剂可以通过抑制致敏因子的生成，提高机体的细胞免疫功能，减缓湿疹的病情发展。

综上所述，六月青醇提物凝胶剂可明显改善湿疹早期皮肤表皮炎症反应的发生，保护湿疹大鼠的皮肤屏障，改善湿疹的病理变化；并通过上调大鼠血清中IFN-γ 水平、矫正Th1/Th2 的免疫失衡，抑制致敏因子的生成，提高机体的细胞免疫功能，减缓湿疹的病情发展。