Msi1过表达对宫颈癌细胞增殖及干性维持的影响及其机制

刘 宪,张燕茹,2,陈 茜,冯 倩,2,崔 南*

(1西安交通大学第一附属医院生殖医学科,西安 710061;2西安交通大学医学部;*通讯作者,E-mail:cuin2003@xjtufh.edu.cn)

宫颈癌是严重影响生活质量、威胁女性健康的生殖系统恶性肿瘤,是世界第四大高发肿瘤[1]。尽管宫颈癌的筛查和疫苗的推广大大推进了其早期发现与治疗,但是宫颈癌发病年轻化及难治性宫颈癌仍然为临床医生面对的一个巨大挑战。宫颈癌的发生需要一个漫长的过程,如不及时干预肿瘤将快速生长,甚至发生转移,严重降低了宫颈癌病人的生存期和生活质量。

Msi1是RNA结合蛋白Musashi家族的成员之一,能够通过对靶基因的mRNA转录后及翻译环节发挥抑制或激活作用而调控靶基因的蛋白表达。以往研究显示Msi1在多种肿瘤组织及细胞中的表达上调[2-5]。Msi1能够特异性识别并结合靶基因的mRNA3′UTR区,即(G/A)UnAGU(n=1-3),调控靶基因的表达[6-8]。Msi1不仅在神经干细胞、胚胎发育过程中发挥作用,而且还参与了肿瘤增殖、凋亡、转移及肿瘤干细胞的自我更新等过程,其中涉及了Notch、Akt、Wnt等多个通路。Msi1在宫颈癌的进展中发挥何种作用研究仍较少。既往研究报道Msi1能够加快宫颈癌细胞的细胞周期G0/G1-S转换进而促进宫颈癌细胞的增殖[9],但Msi1对宫颈癌细胞增殖调控作用是否存在其他途径有待进一步深入探讨。Msi1对宫颈癌细胞干细胞样特性的影响目前仍然不十分明确。因此,本研究拟构建Msi1稳定表达的宫颈癌SiHa、HeLa细胞系,通过裸鼠成瘤、细胞计数、软琼脂克隆形成实验观察Msi1对宫颈癌细胞增殖、肿瘤形成能力的影响,通过肿瘤球培养的方法观察Msi1对宫颈癌细胞干细胞样特性的影响,通过报告基因分析、real-time PCR、Western blot探讨Msi1通过何种机制对宫颈癌增殖及肿瘤干细胞样特性发挥作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

宫颈癌细胞系SiHa、HeLa购于美国模式培养物寄存库(American Type Culture Collection, ATCC)。Msi1过表达载体由pCAG-IRES2-AcVEC-neo构建(pCAG-IRES2-AcVEC-Msi1)并保存于西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室。培养宫颈癌细胞系SiHa、HeLa的DMEM培养基购自上海源培生物科技有限公司,胎牛血清购自美国Biological Industries公司,Msi1蛋白抗体购于中国台湾Abnova公司,β-catenin、SOX2、GAPDH蛋白抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养及Msi1稳定表达宫颈癌细胞株的构建

在含10%胎牛血清的DMEM培养基中接种人宫颈癌细胞系SiHa、HeLa细胞,于5% CO2、37 ℃常规培养。前期研究中,稳定过表达Msi1的宫颈癌SiHa、HeLa细胞株已成功制备。在SiHa-Msi1组中选取两个Msi1稳定过表达的单克隆(分别编号为SiHa-Msi1-1和SiHa-Msi1-2),在SiHa-EGFP组中选取两个单克隆(分别编号为SiHa-EGFP-1和SiHa-EGFP-2);在HeLa-Msi1组中选取两个Msi1稳定过表达的单克隆(分别编号为HeLa-Msi1-1和HeLa-Msi1-2),在HeLa-EGFP组中选取两个单克隆(分别编号为HeLa-EGFP-1和HeLa-EGFP-2),以上细胞用于后续实验,并均通过G418压力筛选,以维持Msi1稳定表达的宫颈癌细胞在G418选择性培养基中生长,并保存于本实验室[9]。

1.3 裸鼠成瘤实验检测体内肿瘤形成能力

通过此方法检测不同组宫颈癌细胞在裸鼠体内形成的肿瘤的大小和质量,评估Msi1过表达对宫颈癌细胞体内肿瘤形成能力的影响。选取4-6周雌性BALB/c裸鼠,分别将对数生长期的Msi1过表达的SiHa细胞(SiHa-Msi1)及其对照组(SiHa-EGFP)、Msi1过表达的HeLa细胞(HeLa-Msi1)及其对照组(HeLa-EGFP)注射入小鼠的背部两侧。准备约200 μl含有1×106个细胞的培养基混匀用于接种。于接种后每隔3 d用卡尺测量一次肿瘤大小,体积(mm3)按标准公式计算:长×宽2/2。实验结束时,解剖肿瘤,测量每只小鼠肿瘤的净重。实验方案经西安交通大学医学院动物保护与使用委员会审定。

1.4 细胞计数检测肿瘤细胞体外增殖速度

通过此方法检测肿瘤细胞的体外增殖速度,以评估Msi1过表达对肿瘤细胞增殖能力的影响。本研究将5×104个Msi1过表达细胞及相应的对照细胞分别接种于35 mm培养皿,并加入2 ml培养基,每组设置3个复孔。分别于接种后的第1,4,7天收取细胞,使用细胞计数板在光学显微镜下进行细胞计数并记录。

1.5 软琼脂克隆形成实验检测肿瘤细胞恶性增殖能力

通过本方法检测软琼脂中悬浮形成的肿瘤细胞单克隆数量,评估Msi1过表达对肿瘤细胞恶性增殖程度的改变。取对数生长期的Msi1过表达细胞及相应的对照细胞,用0.25%胰蛋白酶处理使之成为单细胞,作活细胞计数,用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106/ml。用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后维持在40 ℃环境中保证其不发生凝固。将1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)等体积混合,取1 ml混合液注入6孔板中,冷却凝固,可作底层琼脂置于37 ℃、5% CO2温箱中备用。将0.7%的琼脂糖和配置好的2倍浓度的DMEM(2×DMEM)培养基等体积加入无菌管,再加入细胞悬液,使SiHa细胞(SiHa-Msi1,SiHa-EGFP)数量达3 000个/管,HeLa细胞(HeLa-Msi1,HeLa-EGFP)数量达5 000个/管,并使每管总体积达1 ml,充分混匀,注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中,形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后,置入37 ℃、5% CO2温箱中培养14-28 d。将6孔板置于倒置显微镜下,观察细胞克隆数,计算形成率。每组细胞设置3个复孔。

1.6 肿瘤球培养及连续肿瘤球形成实验检测肿瘤干细胞样特性

通过计数原代细胞及成肿瘤球后重新种植后形成的肿瘤球数量,检测Msi1过表达对宫颈癌干细胞样特性的改变。收集对数生长期Msi1过表达细胞及相应的对照细胞,接种于由DMEM/F12基础培养基、N2和B27补充剂(Invitrogen)、20 ng/ml人类重组表皮生长因子(EGF)和20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)组成的干细胞培养基。对于肿瘤球形成试验,在96孔中以1个细胞/150 μl的密度接种细胞,在干细胞培养基中培养。记录2周内出现的肿瘤球。收集96孔板中的肿瘤球,用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化细胞,并如上所述重新接种。连续传代2次。每种细胞类型均设置为3个复孔,两个人以盲法计数。

1.7 real-time PCR检测基因mRNA的表达水平

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.8 报告基因分析(TOP-Flash/FOP-Flash)检测Wnt通路活性

将TOP-Flash reporter和pTK-RL质粒用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分别瞬时共转染到接种在24孔板的Msi1过表达细胞及相应的对照细胞中,按照说明书使用双荧光素酶分析试剂盒(Promega,Madison,WI,USA)进行转染,在转染后48 h测定Firefly和Renilla荧光素酶报告基因的活性。Firefly荧光素酶活性与Renilla荧光素酶活性的相对比值表示TOP-Flash报告基因活性。所有实验进行3次,每个样品设置3个复管。

1.9 Western blot检测Wnt通路相关蛋白表达水平

收集对数生长期的Msi1过表达细胞及相应的对照细胞,收集细胞蛋白并进行浓度定量。用SDS-PAGE分蛋白,然后转移到PVDF膜上。将PVDF膜用5%无脂牛奶封闭后,用抗人Msi1(1 ∶1 000稀释)、β-catenin(1 ∶1 000稀释)、SOX2(1 ∶1 000稀释)、GAPDH(1 ∶1 000稀释)的一抗4 ℃孵育过夜,洗膜,然后用二抗室温孵育1 h,再次洗膜,最后用增强化学发光试剂(Millipore,Billerica,MA,USA)进行发光反应,通过Western blot化学发光成像一体机(陕西鑫来博生物工程有限公司)拍照、观察。将目标蛋白的Western blot结果与GAPDH的Western blot结果用ImageJ进行标准化以进行定量。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 Msi1过表达对宫颈癌细胞的体内肿瘤形成的影响

裸鼠体内成瘤实验结果显示,裸鼠背部种植40 d,SiHa-Msi1组细胞形成的肿瘤质量显著大于SiHa-EGFP组(P<0.05),且肿瘤体积亦显著大于SiHa-EGFP组体积(P<0.05,见图1)。相似地,HeLa-Msi1组形成的肿瘤质量显著大于HeLa-EGFP组(P<0.05),肿瘤体积亦显著大于HeLa-EGFP组(P<0.05,见图1)。这些结果表明,Msi1过表达能够促进宫颈癌细胞在体内的肿瘤形成。

图1 Msi1过表达对宫颈癌细胞的体内肿瘤形成的影响Figure 1 Effect of Msi1 overexpression on tumor formation of cervical cancer cells in vivo in nude mice

2.2 Msi1过表达对宫颈癌细胞体外增殖的影响

细胞计数结果显示,细胞接种后第7天SiHa-Msi1组和HeLa-Msi1组细胞数量显著高于相应的对照组(P<0.05,见图2)。软琼脂克隆形成实验结果显示,SiHa-Msi1组和HeLa-Msi1组细胞形成的单克隆数量显著多于相应的对照组(P<0.05,见图3)。以上结果显示,外源性过表达Msi1促进了宫颈癌细胞的增殖能力。

图2 细胞计数法检测Msi1过表达对宫颈癌细胞的体外增殖的影响Figure 2 Effect of Msi1 overexpression on the proliferation of cervical cancer cells in vitro by cytometry

图3 软琼脂克隆形成实验检测Msi1过表达对宫颈癌细胞的体外增殖的影响Figure 3 Effect of Msi1 overexpression on the proliferation of cervical cancer cells in vitro by soft agar colony formation assay

2.3 Msi1过表达对宫颈癌细胞的干细胞样特性的影响

96孔板肿瘤球形成实验中,SiHa-Msi1组细胞原代、初代肿瘤球形成的数量具有增多趋势,且次代肿瘤球形成的数量显著多于SiHa-EGFP组(P<0.05,见图4);相似地,HeLa-Msi1组细胞原代、初代肿瘤球形成的数量具有增多趋势,且次代肿瘤球形成的数量显著多于HeLa-EGFP组(P<0.05,见图4)。同时,SiHa-Msi1组和HeLa-Msi1组细胞形成肿瘤球的直径明显大于相应的对照组(P<0.001,见图4)。以上结果显示,外源性过表达Msi1显著增强了宫颈癌细胞干细胞样特性的维持。

图4 Msi1过表达对宫颈癌细胞干细胞样特性的影响Figure 4 The effect of Msi1 overexpression on stem cell like characteristics of cervical cancer cells

2.4 Msi1过表达对干细胞相关因子及Wnt/β-catenin通路的作用

real-time PCR检测Klf4、Oct4、Sox2、Aldh的mRNA水平的结果表明,SiHa-Msi1细胞与SiHa-EGFP细胞相比,Sox2、Oct4、Aldh的RNA水平显著上调(P<0.05,见图5),但Klf4的RNA水平无明显变化(P>0.05);相似地,HeLa-Msi1细胞与HeLa-EGFP细胞相比,Sox2、Oct4、Aldh的RNA表达亦呈现显著上调(P<0.05),但Klf4 的RNA水平无明显变化(P>0.05,见图5)。TOP-Flash/FOP-Flash实验检测Wnt通路活性的结果显示,与相应对照组相比,SiHa-Msi1组和HeLa-Msi1组细胞中,Wnt通路活性显著增强(P<0.05,见图6)。Western blot结果显示,与相应对照组相比,SiHa-Msi1组和HeLa-Msi1组细胞中Wnt通路下游β-catenin、SOX2蛋白表达均上调(P<0.05,见图7)。以上结果说明Msi1的表达可能活化了Wnt/β-catenin通路,从而上调SOX2的表达。

图5 Real-time PCR检测Msi1过表达对宫颈癌干细胞相关因子表达水平的变化Figure 5 Effect of Msi1 overexpression on stem cell related factors by real-time PCR

图6 TOP-Flash/FOP-Flash检测Msi1过表达对Wnt通路活性的作用Figure 6 Effect of Msi1 overexpression on Wnt pathway in cervical cancer by TOP-Flash/FOP-Flash

图7 Western blot检测Msi1过表达对Wnt通路下游蛋白的表达变化Figure 7 Effect of Msi1 overexpression on Wnt signaling downstream protein levels by Western blot

3 讨论

宫颈上皮从不典型增生向原位癌、浸润癌发展,甚至转移至周边及远处器官,宫颈癌的发生、发展是一个较为缓慢的过程。虽然HPV感染是一个重要的促癌因素,但在复杂的机体内环境下多种抑癌和促癌因子的异常表达更是宫颈癌发生、发展、恶化的重要因素。在多种肿瘤中高表达的RNA结合蛋白Msi1被认为是一种促癌因子[6,10]。为探究Msi1蛋白高表达在宫颈癌细胞的作用,Msi1稳定表达的宫颈癌SiHa、HeLa细胞株在前期研究中已成功构建[9],并作为本研究的研究对象。在本研究中,细胞计数、软琼脂克隆形成实验的结果提示Msi1过表达增强了宫颈癌细胞的体外增殖能力;体内成瘤实验的结果表明Msi1过表达增强了宫颈癌细胞体内肿瘤形成能力。通过体内、体外实验,本研究进一步证实了Msi1促进肿瘤增殖的作用,与既往研究结果一致[9]。

有研究表明,Msi1在胶质母细胞瘤、乳腺癌中促进了肿瘤的干细胞样特征[11,12]。本研究中原代培养的肿瘤球形成实验中过表达Msi1的SiHa、HeLa细胞表现出了较强的肿瘤球形成能力,随着传代次数的增加,肿瘤形成的能力明显增强,说明Msi1对宫颈癌细胞的干细胞样特性维持具有促进作用,亦进一步验证了Msi1在恶性肿瘤中对肿瘤干细胞样特性的影响。有研究表明,ALDH为宫颈癌干细胞标记,Sox2表达的宫颈癌细胞表现出了干细胞样特性[13,14]。Oct4、Klf4是干细胞相关的核转录因子,这些因子的表达促进了肿瘤的进展[15,16]。在本研究中,过表达Msi1的SiHa、HeLa细胞内干细胞相关基因Sox2、Oct4、Aldh的RNA水平明显增加,提示Msi1过表达促进这些干细胞相关因子的激活,提示Msi1过表达可能通过活化了干细胞相关因子而促进宫颈癌细胞的干细胞样特性。亦有研究显示,Msi1表达减低,能够降低CD133、Bmi1、Sox2、Oct4等肿瘤干细胞标记物[17],与本研究结果相似。

以往研究显示Msi1通过Wnt通路促进了肿瘤细胞的生存能力、侵袭及迁移能力、肿瘤干细胞的增殖能力[18,19]。本研究对Msi1过表达对宫颈癌细胞中Wnt通路活性的作用进行了验证,TOP-Flash/FOP-Flash实验提示经典Wnt通路在Msi1过表达的宫颈癌细胞中活性增加。β-catenin和SOX2作为Wnt通路的下游,同样反映了Wnt通路的活性[20,21]。本研究中Western blot结果显示β-catenin和SOX2蛋白表达上调,说明Msi1的表达可能激活了经典Wnt通路,从而促进了宫颈癌细胞的增殖及干细胞样特性。然而,Msi1通过调控何种靶基因发挥对Wnt通路的活性的激活作用仍有待进一步探索。

综上所述,本研究揭示了在宫颈癌细胞中Msi1过表达可能通过激活Wnt/β-catenin/Sox2通路促进了宫颈癌细胞的增殖和干细胞样特性,从而促进了肿瘤的进展,为探讨Msi1能否作为宫颈肿癌诊断和治疗的靶基因提供了一个更为稳固的科研基础。