蒙药嘎日西散质量标准研究

2021-12-16特格喜白音敖登其木格田吉王海荣

世界中医药 2021年19期

特格喜白音敖登其木格田吉王海荣

摘要目的：建立蒙药嘎日西散的质量标准。方法：采用显微鉴别法对制剂中大黄、诃子、土木香、黑冰片、豆蔻、荜茇、山柰、石榴8味药材进行定性鉴别，选取薄层色谱法对制剂中荜茇、大黄及连翘3味药材进行定性鉴别，采用理化鉴别法对制剂中面碱进行定性鉴别，采用高效液相色谱法测定蒙药嘎日西散中游离大黄酚含量。结果：显微鉴别特征明显;薄层鉴别的色谱斑点清晰，阴性对照无干扰，专属性强。高效液相色谱法大黄酚进样量在47.45～1 898 ng范围内呈良好的线性关系，r=1，平均回收率为97.08%，RSD为1.12%（n=6）。结论：本实验建立的分析方法准确、稳定、重复性好，适用于蒙药嘎日西散的质量控制。

关键词嘎日西散;显微鉴别法;薄层色谱法;高效液相色谱法;大黄酚;含量测定;质量标准

Abstract Objective：To establish quality standards for Garixi Powder.Methods：Microscopic identification was used for qualitative determination of rhubarb，fructus chebulae，elecampane inula root，black borneol，fructus amomi rotundus，piperis longi，rhizoma kaempferiae and punica granatum.Thin layer chromatography was applied for qualitative determination of piperis longi，rhubarb，and fructus forsythiae.Physical and chemical identification was used for qualitative determination of sodium carbonate decahydrate.High performance liquid chromatography was used for quantitative determination of free chrysophanol in thepowder.Results：The microscopic determination features were obvious and exclusive.TLC chromatographic spots were clear，and there was no interference for negative samples.A good linearity of chrysophanol was shown in range of 47.45～189 8 ng（r=1） with high performance liquid chromatography.The average recovery of chrysophanol was 97.08%，and the RSD was 1.12%（n=6）.Conclusion：The methods in this research are simple，sensitive，accurate，and with good reproducibility.It can be used for quality control of Garixi Powder.

Keywords Garixi Powder; Microscopic identification; Thin layer chromatography; High performance liquid chromatography; Chrysophanol; Content determination; Quality standard

中圖分类号：R29;R289.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.011

蒙药嘎日西是由寒水石、诃子、大黄、山柰、面碱、黑冰片、牛胆膏粉、荜茇、石榴、豆蔻、连翘等15味药组成的蒙药复方制剂。本验方“嘎日西”由《至高药方》中具有祛寒性“协日”、消积功效的哈日嘠布日十味散和《蒙药秘诀方海》中具有消肿理气的阿木日六味散组成[1]。主治反流性胃炎、胃痛胃酸、脘腹胀痛、嗳气吞酸、大便秘结，经过近20年的临床应用，效果良好[2]。该药方具有祛寒性“协日”“胃宝日”，消肿理气，消积通便作用，为蒙医常用制剂之一，临床使用广泛，疗效可靠。为控制其质量，保证临床疗效，对该蒙药复方制剂进行质量标准研究，本研究采用显微鉴别法、薄层色谱法（TLC）及理化鉴别法对处方中大黄、诃子、荜茇和土木香等主要药物进行定性鉴别，选用高效液相色谱法（HPLC）对处方君药大黄的主要有效成分大黄酚进行定量分析，从而为建立其质量标准提供有效依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技，美国，型号：Ultimate3000）;荧光显微镜（尼康株式会社，日本，型号：Ti-U）;超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司，型号：KQ-500DE）;暗箱式紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司，型号：ZF-7）;电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，德国，型号：BT25S）。

1.2 试剂大黄对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：120984-201202），荜茇对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：121023-201103），连翘对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：120908-201216），大黄酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110796-201621），硅胶G薄层板、硅胶GF254薄层板（青岛海洋化工厂，批号：071713），其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 分析样品嘎日西散（内蒙古自治区国际蒙医医院，批号：20150111、20160206、20161106）。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别取嘎日西散粉末，用水合氯醛装片，显微观察[3]，大黄草酸钙簇晶棱角大多短钝;诃子石细胞类圆形、卵圆形，孔沟明显，具层纹;土木香菊糖无色，呈扇形或不规则碎块状;黑冰片碎片黑色、呈不规则碎块状;豆蔻内种皮细胞红棕色，细胞系小，呈多角形;荜茇外胚乳细胞呈亮黄色，细胞内充满淀粉粒;山柰淀粉粒众多，主为单粒，圆形，椭圆形或类三角形，多数扁平，直径5～30 μm，脐点、层纹均不明显。石榴石细胞无色，椭圆形或类圆形，壁厚，沟孔细密。见图1。

2.2 TLC鉴别

2.2.1 荜茇的TLC鉴别 1）取不同批号的嘎日西散各2 g，分别加无水乙醇7.5 mL，超声处理30 min，滤过，滤液浓缩至约1 mL，作为供试品溶液。2）按处方比例和制备工艺制成阴性样品（缺荜茇）和模拟样品，同供试品溶液制法相同，制得阴性样品溶液和模拟样品溶液。3）取荜茇对照药材0.5 g，加无水乙醇5 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，加1 mL无水乙醇溶解制得对照药材溶液。参照薄层色谱法实验[3]，在同一硅胶G薄层板上，分别吸取上述4种溶液各10 μL，点样，展开剂选取甲苯-乙酸乙酯-丙酮（7∶2∶1），展开晾干后，置紫外光灯（365 nm）下检视。在与对照药材色谱相应位置（Rf值0.57），供试品和模拟样品色谱显现颜色相同的斑点，阴性无干扰。见图2。

2.2.2 大黄的TLC鉴别 1）取不同批号的嘎日西散各1.5 g，分别加甲醇6 mL，超声处理10 min，滤过，滤液作为供试品溶液。2）按处方比例和制备工艺制成阴性样品（缺大黄）和模拟样品，同供试品溶液制法相同，制得阴性样品溶液和模拟样品溶液。3）称取0.3 g的大黄对照药材粉末，加入3 mL甲醇，超声处理10 min后过滤，滤液作为对照药材溶液[4-8]。参照薄层色谱法实验[3]，在同一硅胶GF254薄层板上，分别吸取上述4种溶液各10 μL，点样，展开剂选取环己烷-乙酸乙酯-甲酸（12∶3∶0.1），展开晾干后，置紫外光灯（365 nm）下检视。在与对照药材色谱相对应的位置，供试品和模拟样品色谱显现颜色相同的5个斑点（Rf值分别为0.79，0.64，0.39，0.24，0.21），阴性对照色谱相应的位置上无斑点。见图3。

2.2.3 连翘的TLC鉴别 1）取不同批号的嘎日西散各0.5 g，分别加石油醚（30～60 ℃）20 mL并密塞，超声处理15 min，滤过，弃去石油醚液，残渣挥干石油醚，加甲醇5 mL，密塞，超声处理20 min，滤过，滤液作为供试品溶液。2）按处方比例和制备工艺制成阴性样品（缺连翘）和模拟样品，同供试品溶液制法相同，制得阴性样品溶液和模拟样品溶液。3）取连翘对照药材0.2 g，同上述方法1）制得对照药材溶液。参照薄层色谱法实验[3]，在同一硅胶G薄层板上，分别吸取上述4种溶液各10 μL，点样，展开剂选取三氯甲烷-甲醇（8∶1），展开，取出薄层板晾干，向板上喷洒10%硫酸乙醇溶液，在烘箱中105 ℃加热至斑点显现清晰的顏色。在与对照药材色谱相应位置（Rf值0.35），供试品和模拟样品色谱显现颜色相同的斑点，阴性无干扰。见图4。

2.3 面碱的理化鉴别取嘎日西散0.5 g，加稀盐酸10 mL，有气泡产生。见图5。称取本品处方工艺制备不含面碱的阴性样品0.5 g，加稀盐酸10 mL，无气泡产生。表明处方中其他组分对面碱鉴别无干扰，具专属性。

2.4 大黄酚的含量测定

2.4.1 色谱条件色谱柱为C18柱（Thermo scientific，250 mm×4.6 mm，5 μm）;以乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相，按42∶23∶35的比例等度洗脱;进样量为10 μL;体积流量：1.0 mL/min;柱温：25 ℃;检测波长为254 nm。在上述条件下，理论板数以大黄酚峰计不少于1 500，分离度>1.5。

2.4.2 对照品溶液的制备精密称取9.49 mg大黄酚对照品，加入100 mL甲醇制成1 mL含0.094 9 mg大黄酚的溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备精密称取3 g嘎日西散，精密加入25 mL甲醇，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）45 min，放冷，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4.4 阴性对照溶液的制备取大黄阴性样品，同供试品溶液制备方法，制得缺大黄的阴性对照溶液。

2.4.5 专属性试验按色谱条件测定大黄阴性对照溶液、供试品溶液、大黄酚对照品溶液，结果可见，在与对照品色谱中大黄酚峰对应的位置上，供试品色谱图检出色谱峰，而阴性样品在相应的位置上无相应峰出现，说明方中其他药味对大黄酚的测定无干扰[9-11]。见图6。

2.4.6 线性关系考察取大黄酚对照品溶液（0.094 9 mg/mL），分别进样0.5 μL、1.0 μL、2.0 μL、5.0 μL、10.0 μL、20.0 μL，在色谱条件下进行检测，记录色谱峰的峰面积。以横坐标为大黄酚进样量（ng），纵坐标为不同进样体积所对应的色谱峰峰面积绘制标准曲线，得到大黄酚进样量在47.45～1 898 ng范围内，线性关系良好，回归方程为：y=0.088 1x+0.166 1，r=1。

2.4.7 精密度试验取大黄酚对照品溶液（0.094 9 mg/mL），在上述色谱条件，连续进样6次，记录每次所测的色谱峰面积[12]。大黄酚色谱峰面积的RSD（n=6）为0.62%，仪器精密度良好。

2.4.8 供试品溶液稳定性试验取同一供试品溶液，按色谱条件进样，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h测定，以大黄酚峰面积计算，其峰面积的RSD值为0.09%，室温条件12 h内，样品稳定性良好[8，13]。

2.4.9 重复性试验取批号的20161106的嘎日西散，按供试品溶液制备法[14]，平行处理6份，按色谱条件测定嘎日西散中游离大黄酚的含量，得含量均值为0.296 3 mg/g，RSD为0.55%（n=6）。见表1。

2.4.10 回收率试验分别精密称取已知游离大黄酚含量（0.296 3 mg/g）的样品1.5 g，各6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入浓度为0.094 9 mg/mL的大黄酚对照品溶液5 mL（约相当于供试品含有量的50%），加20 mL甲醇，按供试品溶液制备方法制备和色谱条件进样检测，计算加样回收率和RSD值[15-17]。6次加样回收率平均值为97.08%，RSD为1.12%。见表2。

2.4.11 样品测定结果取不同批次样品，按上述供试品溶液的制备方法和测定条件，测定了3批嘎日西散中游离大黄酚含量[18-19]，每批平行测3份，样品中游离大黄酚含量测定见结果表3。20161106批次样品平均含量为0.294 9 mg/g，20160206批次样品平均含量为0.452 8 mg/g，20150111批次样品平均含量为0.476 5 mg/g。

3 讨论

本研究中荜茇和连翘的TLC鉴别分别参考了《中华人民共和国药典》（2015年版一部）》中的“荜茇”和“连翘”鉴别项下分析方法进行薄层展开，结果所得薄层色谱斑点清晰，专属性强，方法简便可行。在大黄TLC预实验中，首先参照药典中“大黄”鉴别项下分析方法[3]，制备供试品溶液时，取嘎日西散粉末，用甲醇浸泡1 h，滤过，滤液蒸干后加适量超纯水溶解后加盐酸加热回流，冷却后，乙醚振摇提取2次，蒸干后加入三氯甲烷复溶制得。选取羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板，展开剂为石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上层溶液，进行薄层色谱分析。试验结果中，色谱斑点不清晰，专属性较差。本研究大黄TLC鉴别实验中，供试品直接加甲醇超声，过滤，滤液点样。展开剂选为环己烷-乙酸乙酯-甲酸（12∶3∶0.1），薄层板选为硅胶GF254薄层板时，TLC能达到良好的分离、斑点清晰、重复性好、阴性对照无干扰。该方法供试品溶液制备方法简单，使用的硅胶GF254薄层板为常用薄层板，易得，结果所得色谱斑点清晰，分离较好。

结合三批样品的实测结果，本品每1 g含大黄以游离大黄酚（C15H10O4）计，均大于0.29 mg，结果暂定以最低含量的80%作为限度，故暂定本品每1 g含大黄以游离大黄酚（C15H10O4）计，不得少于0.23 mg。

嘎日西散中大黄为处方的君药，具有清热、解毒作用。蒽醌类化合物是大黄的主要有效成分。本研究中含量测定首先参考药典“大黄”项下含量测定方法，流动相采用甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）。但因嘎日西散复方制剂的成分多而复杂，用此流动相时，大黄酚色谱峰未能与其他干扰峰得到很好的分离。经过色谱条件探索，将流动相成分和比例调整成乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（42∶23∶35）时，待测物峰分离良好。在定量分析过程中，首先测定制剂中总大黄素、总大黄酚、游离大黄素、游离大黄酚，但在多次测定后发现，总大黄素、总大黄酚、游离大黄素测定方法准确度的回收率均低于50%，因此，本研究最终选用游离大黄酚含量为蒙药嘎日西散质量控制指标。综上所述，本研究所建标准可用于蒙药嘎日西散的质量控制。

参考文献

[1]巴托，巴都木才次克，洪格爾.蒙药嘎日西的研究进展[J].世界最新医学信息文摘（连续型电子期刊），2018，18（6）：56-57，60.

[2]桂荣.利肝和胃丸、哈日十二味散、嘎日西治疗慢性胃炎[J].中国医药指南，2010，8（29）：241-242.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：200.

[4]吴桐，张巧丽，姚树坤.清肝化瘀方质量标准研究[J].世界中医药，2017，12（10）：2457-2461.

[5]吕玲玲，郑岚，谢松.葛芪颗粒的质量标准研究[J].世界中医药，2017，12（10）：2478-2481.

[6]杨怀武，王碧辉，阎玉珍.维血宁颗粒（无糖型）的质量标准[J].中国药师，2010，13（10）：1528-1529.

[7]魏秋宇，马海春.补脾治瘫丸质量标准研究[J].海峡药学，2017，29（12）：83-85.

[8]洪绍兴，黄焕麟，钟莉.院内制剂肝利泰片质量定性的研究[J].北方药学，2016，13（8）：4-5.

[9]王英俊，赵秀芬.嘎日西胶囊含量测定[J].中国民族医药杂志，2009，15（2）：48-50.

[10]田申武，韩塔娜，旭红.反相HPLC法测定嘎日西胶囊中大黄酚的含量[J].中国民族医药杂志，2010，16（1）：49-50.

[11]谷薇薇，王晓娟.桑叶复合固体饮料的制备及质量标准研究[J].中药材，2018，41（4）：943-945.