新疆南疆绵羊棘球蚴和细颈囊尾蚴的分子鉴定

丁繁萍，黄跃杰，鱼海玮，马纾薏，孟凡艳，石长青，胡建军*

(1.塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团第一师畜牧兽医工作站，新疆阿拉尔 843300)

棘球蚴病(Echinococcosis)又称包虫病，是棘球绦虫的中绦期棘球蚴感染所致，牛、羊、人等为中间宿主，狗、豹、鬣狗等为终末宿主，棘球蚴主要寄生于肝、肺等器官[1]。在分类上属于带科棘球属。棘球属包含5个种，即细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)、多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis)、石渠棘球绦虫(Echinococcusshiqucus)、少节棘球绦虫(Echinococcusoligarthrus)和福氏棘球绦虫(Echinococcusvogeli)，我国以前3个种较为多见，其中对人畜危害最严重的为细粒棘球绦虫[2]。细颈囊尾蚴(Cysticercustenuicollis)俗称水铃铛，是泡状带绦虫的中绦期，绵羊、猪是其中间宿主，在牛和其他野生反刍动物的肝脏、肠系膜及其他器官中有时可见，感染严重时还会寄生于肾脏等器官[3-4]。

棘球蚴具有不同的基因型，且形态学分类方法不统一，为棘球蚴基因型鉴定带来了困难[5-6]。棘球蚴线粒体基因组中编码细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ基因(COI基因)和NADH脱氢酶Ⅰ基因(NDI基因)的差异常用于线粒体基因型的变化程度研究[7-8]；细颈囊尾蚴的Cytb基因进化速度适中，适用于种内到科间甚至于科间的系列进化关系、种群水平的研究[9]。本研究以传统分类学为基础，采用棘球蚴COI基因、NDI基因和细颈囊尾蚴Cytb基因进行分子生物学基因分型鉴定，为包虫病的分子流行病学和遗传演化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 新疆南疆某羊场部分羊只出现消瘦、精神萎靡不振。剖检可观察肝脏有大小不等的棘球蚴囊泡；肝脏、肠系膜上有鸡蛋大小的细颈囊尾蚴囊泡黏附。采集棘球蚴囊泡、细颈囊尾蚴囊泡保存备用。

1.1.2 仪器设备 旋涡混合器，三孔三温水浴锅，单道微量移液器，超净工作台，电泳仪，凝胶成像仪。

1.1.3 主要试剂 血液/细胞/组织DNA提取试剂盒、2×TaqPCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 形态学检查 剥离肝脏上棘球蚴、细颈囊尾蚴囊泡置于洁净的平皿，无菌注射器抽取囊泡中囊液，滴加于载玻片，镜检。

1.2.2 样本总DNA提取 参照“血液/细胞/组织DNA提取试剂盒”说明书，提取棘球绦虫、细颈囊尾蚴虫体组织总DNA，置-20 ℃保存备用。

1.2.3 引物设计与合成 参照文献[10-11]中棘球蚴基因分型特异性引物COI基因引物(COI-F、COI-R)和NDI基因引物(NDI-F、NDI-R)、细颈囊尾蚴基因分型特异性引物Cytb基因引物(Cytb 1、Cytb 2)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.2.4 参考序列 文中涉及的棘球蚴、细颈囊尾蚴参考株基因序列均下载于NCBI中GenBank。

1.2.5 PCR反应 棘球蚴COI、NDI基因PCR反应体系(50 μL)：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 18 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环； 72 ℃延伸10 min。细颈囊尾蚴Cytb基因PCR反应体系(50 μL)：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，引物Cytb 1和Cytb 2各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 18 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。分别取上述5 μL PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6 PCR产物纯化回收 PCR扩增产物切胶，按照TIAN gel Midi Purification Kit试剂盒说明书纯化回收PCR产物，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.7 序列分析 测序结果在NCBI中Blast比对，DNA Star软件进行核苷酸序列同源性分析、系统发育分析；MEGA 5.0软件绘制遗传进化树。

2 结果

2.1 病理剖检

剖检可见患羊肝脏表面凹凸不平，表面均有大小不等的棘球蚴囊泡突起，囊泡液呈淡黄色，囊壁分两层(角质层和生发层)；此外在肝脏、肠系膜上附有鸡蛋大小的细颈囊尾蚴囊泡，泡内充满透明囊液。

2.2 镜检

显微镜下观察可见囊液中原头蚴上有小钩吸盘，可见内嵌头节、外翻头节。

2.3 COI、NDI、Cytb基因PCR扩增

以棘球蚴、细颈囊尾蚴虫体组织DNA为模板，棘球蚴特异性引物(COI-F、COI-R和NDI-F、NDI-R)，细颈囊尾蚴特异性引物(Cytb1/Cytb2)，分别扩增出285、510、1 086 bp大小的片段，与预期的目的片段大小相符(图1)。

M.DNA 标准DL 2 000;1.棘球蚴COI基因PCR扩增产物；2、3.棘球蚴NDI基因PCR扩增产物;4.细颈囊尾蚴Cytb 基因PCR扩增产物

2.4 棘球蚴COI、NDI基因核苷酸同源性比较

文中棘球蚴样本分离株命名为GBC，以棘球蚴COI、NDI基因引物(COI-F/COI-R)、(NDI-F/NDI-R)，PCR扩增、测序后在NCBI中进行Blast比对，与棘球蚴参考株核苷酸序列同源性分别可达97%、99%以上(图2和图3)。

图2 棘球蚴COI基因核苷酸同源性比较

图3 棘球蚴NDI基因核苷酸同源性比较

运用DNA Star对棘球蚴COI基因核苷酸序列进行同源性比较；MEGA 5.0软件用邻近法(Neighbor-joining,NJ)构建棘球蚴COI基因系统进化树(图4)

图4 以棘球蚴COI基因构建系统进化树

2.5 细颈囊尾蚴Cytb基因核苷酸同源性比较

将细颈囊尾蚴样本命名为XJNWY，与参考株进行核苷酸同源性比较，运用MEGA 5.0软件采用邻近法(NJ)构建系统进化树。结果显示，该序列与参考株肯尼亚/狮子(AB905198.1)、湖南/猪(FJ518620.1)、甘肃/羊(GQ228819.1)、攀枝花/山羊(JF720928.1)及中国/山羊(KT258035.1)位于同一进化分支上，序列间核苷酸同源性较高(90.9%～99.5%)；而与细颈囊尾蚴参考株芬兰/猪(AB731727.1)、土耳其/羊(KU925396.1)、意大利/牛(KU925423.1)、希腊/羊(KU925430.1)、墨西哥/猪(KX039965.1)、西班牙/羊(KY766903.1)及土耳其/牛(KY766904.1)同源性较低(74.6%～75.0%)(图5和图6)。

图5 细颈囊尾蚴Cytb基因核苷酸同源性比较

图6 细颈囊尾蚴Cytb基因构建系统进化树

3 讨论

棘球蚴病严重危害人畜健康，世界性分布，经济损失严重。利用分子生物学技术，分析棘球蚴各地理株间DNA序列差异，可将其分为10个基因型，包括Gl/羊株(Common sheep strain)、G2/塔斯马尼亚羊株(Tasmanian sheep strain)、G3/水牛株(Buffalo strain)、马株(Horse strain / G4)、牛株(Ordeppi strain / G5) 、骆驼株(Camel strain / G6)、猪株(Pig strain / G7)、鹿株(Cervid strain / G8)、波兰株(Polish strain/G9)及麋鹿株(Fennoscandian cevid strain / G10)。其中，G1基因型在世界大部分地区流行[9]。

我国20多个省区均有棘球蚴感染的相关报道，新疆、甘肃、宁夏、内蒙古、青海、四川等地为高发区，占全国范围的87%[12]。新疆地区棘球蚴常见为G1基因型，其中Meng Q L等[13]报道新疆羊的感染率为9.8%。此外，Guo B P等[12]首次报道了新疆羊群中存在棘球G3基因型感染。在本研究中，所采样本被鉴定为细粒棘球蚴G1基因型。

本研究中，细颈囊尾蚴XJNWY与参考株湖南/猪(FJ518620.1)、甘肃/羊(GQ228819.1)、攀枝花/山羊(JF720928.1)及中国/山羊(KT258035.1)的核苷酸同源性高(90.9%～99.5%)，说明它们种群间遗传差异较小；而与部分国外的细颈囊尾蚴参考株芬兰/猪(AB731727.1)、土耳其/羊(KU925396.1)、意大利/牛(KU925423.1)、希腊/羊(KU925430.1)、墨西哥/猪(KX039965.1)、西班牙/羊(KY766903.1)及土耳其/牛(KY766904.1)同源性较低，仅有74.6%～75.0%。说明相邻地区之间的同源性较相隔较远地区之间的分离株同源性较高。

棘球蚴、细颈囊尾蚴的宿主众多，从形态学上分类，生物表型易受到外界环境的影响，同种不同分离株，在生物学特征方面存在着一定的差异[14]。随着分子生物学技术的发展，从基因水平比较分析同一物种不同分离株的差异，有助于对寄生虫的分类、种和株的分子鉴定和遗传演化的研究。

本研究样本数量有限，新疆南疆地区家畜棘球蚴和细颈囊尾蚴其他基因型混合感染情况有待进一步研究。

本研究对分离自新疆南疆某规模羊场的棘球蚴、细颈囊尾蚴进行基因测序并分析，其结果显示该病例为羊棘球蚴G1基因型和细颈囊尾蚴的混合感染。