牛环形泰勒虫AMA1基因表达载体的构建及生物信息学分析

樊新丽，郑会珍，翟雪洁，范士龙，马 英，陈宋琴，韦丽婷，刘一凡，巴音查汗，张 杨

(新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052)

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 保存于新疆农业大学动物医学学院寄生虫实验室的牛环形泰勒虫阳性DNA。

1.1.2 主要试剂 pET-28a(+)及pEGFP表达载体，由新疆农业大学动物医学学院寄生虫实验室提供；T4DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ、Hind Ⅲ、DNA Marker、大肠埃希氏菌DH5α及BL21(DE3)感受态细胞、PMD18-T，TaKaRa公司产品；PCR产物回收试剂盒，Sigma公司产品；胶回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；质粒小提试剂盒，QINGEN公司产品；其他试剂均为分析纯。

1.1.3 主要仪器 离心机(Cence®H1650)，北京时代北利离心机有限公司产品；电子天平(METTLER TOLEDO)，梅特勒一拖力多(上海)仪器公司产品；DK-600A型电热恒温培养箱，一恒科学仪器(上海)有限公司产品；PCR仪，美国伯乐(Bio-Rad)公司产品；DYY-Ш-5型稳压稳流电仪，北京六一生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1TaAMA1目的基因扩增 按照GenBank中发表的牛环形泰勒虫AMA1基因的序列(登录号：ANW48430.1)，使用Primer5软件设计2对特异性引物。引物序列设计及合成如表1，以牛环形泰勒虫阳性DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共35个循环；72 ℃延伸8 min。PCR产物在10 g/L琼脂糖凝胶电泳验证，按照QIAGEN生物技术有限公司DNA片段纯化试剂盒要求回收目的片段，置-20 ℃保存备用。

表1 引物序列及酶切位点

1.2.2 构建重组pMD18-T-AMA1质粒及验证 将回收产物与pMD18-T连接，连接反应体系如表2。混匀后，放于4 ℃，连接12 h。连接产物转化于大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，对克隆菌进行验证并送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

表2 连接反应体系

1.2.3 构建重组pET-28a-AMA1和pET-28a-AMA1表达质粒及验证 将回收的PCR产物和质粒载体pET-28a及pEGFP分别经内切酶BamHⅠ和HindⅢ于37 ℃双酶切1 h后电泳验证，试剂盒回收酶切PCR纯化产物和质粒载体pET-28a及pEGFP，在T4连接酶作用下按比例混合16 ℃连接过夜，连接产物转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞，均匀涂布于固体培养基培养过夜，挑取单个菌落于液体培养基培养过夜，提取质粒，进行双酶切鉴定。将初步鉴定正确的阳性克隆菌送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，并通过NCBI中Blast进行比对分析。

1.2.4 获得蛋白序列及构建系统发育进化树 使用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的蛋白数据库，以测序比对结果搜索得到TaAMA1蛋白的氨基酸序列信息。以测定蛋白序列利用BlastP搜索模式生物如双芽巴贝斯虫(JN572801.1)、牛巴贝斯虫(QDK56771.1)、吉氏巴贝斯虫(ACY07255.1)、卵形巴贝斯虫(AKR16110.1)、东方巴贝斯虫(AHW45797.1)、恶性疟原虫(AFM28827.1)、莫氏巴贝斯虫(QKY59678.1)、分歧巴贝斯虫(ACC96234.2)、小泰勒虫(XP-766171.1)、马泰勒虫(XP-004833099.1)、田鼠巴贝斯虫(XP-021338488.1)，获得TaAMA1在不同物种中的同源蛋白序列。使用DNA Star软件中的Protean程序分析同源性，用Mega 7.0软件中的Neighbor-Joining(NJ)A方法构建系统进化树，Boot-strap分析重复数设置为1 000。

1.2.5 理化性质分析、抗原表位及亚细胞定位预测 利用生物学信息分析软件对测序结果进行TaAMA1氨基酸理化性质(分子式、分子质量、酸碱性、等电点和稳定性)、亲/疏水性、信号肽、跨膜区域、磷酸化位点、抗原表位、亚细胞定位分析，各软件网址和用途见表3。

表3 各软件网址和用途

1.2.6 蛋白高级结构预测 用SOPMA在线预测软件(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred-sopma.pl)预测牛环形泰勒虫AMA1蛋白的二级结构。

1月17日，水利部召开全国水利系统党风廉政建设工作视频会议，贯彻落实党的十八届三中全会、十八届中央纪委三次全会和习近平总书记重要讲话精神，总结水利系统2013年党风廉政建设和反腐败工作，部署2014年工作。水利部党组书记、部长陈雷强调，要紧密团结在以习近平同志为总书记的党中央周围，标本兼治、惩防并举，锐意进取、扎实工作，大力推进水利系统党风廉政建设和反腐败工作，为水利改革攻坚和跨越发展提供坚强有力的保障。水利部党组副书记、副部长矫勇主持会议，党组成员、中纪委驻部纪检组组长董力作工作报告，部领导胡四一、刘宁、李国英、蔡其华、周学文，总工程师汪洪出席会议。

2 结果

2.1 牛环形泰勒虫AMA1基因PCR扩增

扩增产物大小为828 bp(图1)，与预期的目的基因片段大小相一致。测序结果经Blast比对，与牛环形泰勒虫(KX231677.1)同源性为99.72%。

M.DNA标准DL 2 000；1,2,3.AMA1基因PCR产物；4.阴性对照

2.2 牛环形泰勒虫AMA1基因表达载体的构建及验证

对TaAMA1进行双酶切，经10 g/L琼脂凝胶电泳，pET28a-AMA1酶切片段分别为5 369 bp和828 bp(图2A)，pEGFP-AMA1酶切片段分别为3 355 bp和828 bp(图2B)，经Blast比对，与牛环形泰勒虫(KX231677.1)同源性为99.72%，说明原核真核表达载体构建成功。

2.3 AMA1生物信息学分析

2.3.1 牛环形泰勒虫AMA1同源性分析及构建系统进化树 由图3和图4可知克隆所得TaAMA1基因氨基酸序列与小泰勒虫(Thelieriaparva)同源性最高(69.9%)，遗传距离最近，位于同一个分支，与马泰勒虫(Thelieriaequi)的同源性稍微远，与恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)序列同源性相差更大。

M1.DNA标准DL 15 000；M2.DNA标准DL 2 000； A：1,3.pET-28a-AMA1未酶切；2,4.pET28a-AMA1经BamHⅠ和HindⅢ双酶切； B：1,3.pEGFP-AMA1未酶切；2,4.pEGFP-AMA1经HindⅢ和BamHⅠ双酶切

图3 不同物种AMA1基因核酸序列同源性比对分析

2.3.2 理化性质、信号肽及跨膜区域 利用ExPASy网站在线软件对TaAMA1蛋白的理化特性进行了预测分析，结果显示，TaAMA1基因编码蛋白分子式为C1 331H2 134N398O413S4，原子总数4 280，氨基酸数量为276，分子质量为30.448 ku，理论等电点为9.94，属于碱性蛋白；带负电荷残基(Asp+Glu)总数为24，带正电荷残基(Arg+Lys)总数为41；在体外培养哺乳动物网织细胞内半衰期估计是7.2 h，不稳定系数为37.93(标准40以下为稳定蛋白)，属于稳定蛋白，脂肪系数为70.62，亲水性总平均值为-0.705，预测该蛋白为亲水性蛋白；由ProtScale在线软件预测得知，TaAMA1蛋白的亲水区域多于疏水区域，亲水性预测分析进一步印证了GRAVY值分析的结果，TaAMA1属于亲水蛋白。通过TMHMM Server v.2.0在线发现，该蛋白未见到跨膜信号，因此该蛋白不属于跨膜蛋白。经信号肽预测分析发现，TaAMA1序列中不包含信号肽(图5)。

●本文测定

2.3.3 磷酸化位点 利用Net-Phos3.1 Server网站在线软件对TaAMA1蛋白的磷酸化位点进行了预测分析，结果显示，TaAMA1蛋白氨基酸序列上共有38个磷酸化位点，包括26个丝氨酸磷酸化位点，10个苏氨酸磷酸化位点，2个络氨酸磷酸化位点(图6)。表明TaAMA1蛋白共存在38个潜在的翻译后修饰(post-translation modification,PTM)。

图6 牛环形泰勒虫AMA1蛋白磷酸化位点预测

2.3.4 B细胞抗原表位分析 采用DNA Star程序中Protean软件预测AMA1蛋白B细胞抗原表位，结果见图7。由图7可知，该蛋白属于亲水性蛋白，柔韧性较好；抗原性及表面可及性较高。因此，将AMA1蛋白柔韧性、疏水性、表面可及性及抗原指数进行综合分析，再结合在线软件IEDB分析预测该蛋白含有9个潜在抗原表位，结果见图8和表4。

表4 牛环形泰勒虫AMA1的B细胞表位预测

图7 Protean预测牛环形泰勒虫AMA1蛋白B细胞表位

图8 IEDB预测牛环形泰勒虫AMA1蛋白B细胞表位

2.3.5 亚细胞定位 为进一步揭示TaAMA1在细胞中发挥功能的部位，经PSORTⅡ预测发现，此蛋白定位于细胞核的可能性为87%，位于线粒体、细胞骨架及细胞质中可能性为4.3%。

A.亲疏水性分析；B.跨膜结构预测；C.信号肽预测

2.3.6 二级结构 应用SOPMA软件预测TaAMA1蛋白的二级结构，结果显示，TaAMA1蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占23.91%、7.61%、49.64%、18.84%(图9)。

图9 牛环形泰勒虫AMA1蛋白的二级结构分析

3 讨论

生物信息学是一门医学、统计学、数学、物理学和计算机科学交叉的学科。与传统的研究方法相比，生物信息学方法具有高效和低成本的特点，该方法已被广泛应用于分析预测蛋白质的功能、结构和其他生物学特性。牛环形泰勒虫是一种细胞内寄生虫，至今无有效治疗方法及预防疫苗。AMA1作为高度保守性蛋白，被选定为最有前景的疫苗候选抗原之一，由微线体分泌。微线体蛋白在虫体入侵宿主细胞的早期发挥识别和黏附作用，是免疫原性极强的毒力因子。Deans J A等[13]首次从诺氏疟原虫(裂殖子顶端复合体)中发现AMA1，随后AMA1在顶复门其他种中相继发现。本研究成功克隆出AMA1基因，目的基因为828 bp，与预期片段大小相一致，成功构建了原核表达载体pET28aAMA1及真核表达载体pEGFP-AMA1，预测TaAMA1基因编码蛋白分子式为C1 331H2 134N398O413S4，原子总数4 280，氨基酸数量为276，分子质量为30.448 ku，理论等电点为9.94，不稳定系数为37.93，该蛋白为稳定蛋白，脂肪系数为70.62，亲水性总平均值为-0.705，预测该蛋白为亲水性蛋白，无跨膜区及信号肽，为进一步研究AMA1蛋白的功能奠定基础。

化学修饰是蛋白质加工的主要方式。前体蛋白常需要进行一系列的翻译后修饰才能成为具有功能的成熟蛋白。目前已知的翻译后修饰多达400余种[14]，最常见的有磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化等。磷酸化是蛋白翻译后修饰中最为广泛的共价修饰形式，蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程，调节着包括细胞的增殖、发育、分化、骨架调控、凋亡、新陈代谢等几乎所有的生命活动过程，并且可逆的蛋白质磷酸化是目前所知的最主要的信号传导方式[15]。通过生物信息学在线程序分析TaAMA1蛋白含有38个磷酸化位点，预示其在细胞信号转导的控制具有显著作用，AMA1蛋白可以通过调节这些磷酸化位点实现其生物学功能，同时提示该蛋白具有潜在的抗原表位。蛋白质的亚细胞定位分析有助于确定AMA1蛋白在牛环形泰勒虫体内的主要分布[16]。亚细胞定位分析显示，AMA1位于细胞核的可能性最高(87%)，提示TaAMA1可能在细胞核中发挥作用。

抗原表位分析对研究蛋白质的抗原性具有重要的参考价值。通过开展对抗原表位的研究，既可以了解抗原蛋白的结构和功能，揭示病原的致病机制和免疫机理，也可为研究表位疫苗做准备。对蛋白质的抗原表位鉴定有X线晶体衍射技术和氨基酸序列分析技术。前者虽可获得最详尽的信息，但费时且价格昂贵。在抗原氨基酸序列分析的诸多方法中Jameson-Wolf 法是最常用的方法之一[17]。本研究采用Protean软件结合在线软件IEDB综合分析TaAMA1蛋白的Jameson-Wolf 指数，预测TaAMA1蛋白具有9个抗原表位，提示其具有免疫原性。抗原表位是蛋白质抗原性的基础，正确而详细地绘制蛋白质抗原表位的图谱，对疾病的诊断及预后判定、定点改造蛋白质分子以降低蛋白质药物的免疫原性、设计疫苗分子结构以及免疫干预治疗等具有重要意义。

蛋白质的二级结构因其构型及所处的位置和数量不同而表现出不同的功能[18]。对抗原表位有很大影响。α-螺旋和β-折叠结构规则，不易变形，较难嵌合抗体，一般不作为抗原表位，其主要功能是作为蛋白质骨架起稳定作用。而蛋白质的转角及无规卷曲则比较松散，易于发生扭曲、盘旋并展示在蛋白的表面，成为抗原表位的可能较大[19]。TaAMA1蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占23.91%、7.61%、49.64%、18.84%，其中无规则卷曲占比例最高(49.64%)，提示可能具有多个抗原表位。

本研究成功构建原核表达质粒pET28a-AMA1及真核表达质粒pEGFP-AMA1，同源性及系统进化树分析显示与小泰勒虫氨基酸序列同源性最大，生物信息学分析预测有38个磷酸化修饰位点，亚细胞定位预测位于细胞核的比例为87%，B细胞抗原表位分析显示该蛋白含有9个潜在抗原表位，二级结构预测显示有多个抗原表位，可为后续AMA1是否可作为牛环形泰勒虫候选疫苗分子及研究其结构功能奠定基础。。