儿童支气管哮喘患者血清NETs和IL-4水平表达与发作期中医证型的相关性分析

杨 怡，王永清，李 华（湖南中医药高等专科学校附属第一医院儿科，湖南株洲 412000）

支气管哮喘作为临床常见的呼吸系统疾病，具有进展慢、反复发作等特征[1]。支气管哮喘在中医属“哮病”范畴，是脾肺肾等脏器功能先天不足、宿痰隐伏于肺引发[2]。因此，中医认为脾虚、肾虚是支气管哮喘发生的主要影响因素[3]。中医将哮喘分为实喘和虚喘，其中实喘包括寒喘、热喘，虚喘包括脾虚、肾虚等[4]。研究表明，中医辨证对支气管哮喘发作期患者病情控制有重要意义，辨证治疗可明显提高疗效[5]。中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）是由组蛋白、DNA，抗菌肽及蛋白酶等组成的网状结构[6]。有研究证实，DNA/NETs 可能通过调控炎症反应激活等促进支气管哮喘进展[7]。白介素-4（interleukin-4，IL-4）在支气管哮喘患儿血清中表达水平上调，可作为炎症指标，评估病情严重程度[8]。由于有研究证实，不同中医辩证分型可能与免疫功能及炎症反应有关，因此本研究通过检测支气管哮喘发作期患儿血清NETs 和IL-4 水平，分析二者与支气管哮喘不同中医证型间关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2017年1月～2020年1月本院收治的支气管哮喘急性发作期患儿98 例作为观察组，其中男性63 例、女性35 例，年龄3～14 岁，平均6.62±1.57 岁。纳入标准：①西医诊断符合中华医学会关于儿童支气管哮喘诊断标准[9]；②均处于急性发作期；③中医诊断符合《中药新药临床研究指导原则》相关标准[10]，包括热喘证、寒喘证和虚喘证；④临床资料完整。排除标准：①并发心、肾、肝脏等重要脏器严重不足者；②并发恶性肿瘤者；③并发精神疾病、传染性疾病者；④并发自身免疫性疾病者。入组患儿根据中医证型分为热喘证组37例，寒喘证组28 例和虚喘证组33 例。另选取同期在本院体检的25 例健康儿童作为健康对照组，其中男性16 例，女性9 例，年龄3～14 岁，平均年龄6.57±1.61 岁。本研究入组受试儿童家属均已签署知情同意书，且本研究经本院伦理委员会批准同意。热喘证组、寒喘证组、虚喘证组及健康对照组性别比例、年龄、病程、出生时体重比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 各组一般资料比较（±s）

表1 各组一般资料比较（±s）

项 目 热喘证组（n=37） 寒喘证组（n=28） 虚喘证组（n=33） 健康对照组（n=25） χ2/F P性别 (男/女) 23/14 18/10 22/11 16/9 0.155 0.985年龄 (岁) 6.76±1.64 6.53±1.59 6.61±1.52 6.57±1.61 0.133 0.940病程 (月) 16.91±5.26 16.59±5.34 16.28±5.18 —— 0.125 0.882出生时体重 (kg) 3.64±0.81 3.82±0.78 3.54±0.75 3.79±0.82 0.831 0.479

1.2 仪器与试剂 收集受试儿童性别、出生时体重及入院或体检时年龄、病程、外周血中性粒细胞水平、淋巴细胞水平、单核细胞水平等临床资料。使用肺功能仪（型号：Master Screen，德国Jager公司）检测肺功能指标第1 秒用力呼气量（forced expiratory volume in 1 second，FEV1）占预计值百分比（FEV1%），FEV1/用力肺活量（forced vital capacity，FVC）。

1.3 方法 使用PicoGreen 荧光染料及单管型多功能检测仪（型号：ModulusTM，北京原平皓生物技术有限公司）检测血清游离DNA（cell-free DNA，cf-DNA）/NETs 水平。根据标准品制作的标准曲线计算cf-DNA/NETs 水平。采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 检测血清IL-4 表达水平。

1.4 统计学分析 采用SPSS 21.0 软件对研究数据进行分析，计量资料均符合正态分布，以均数±标准差（±s）形式表示，多组数据比较采用单因素方差分析，总体有差异进一步通过SNK-q检验。计数资料用例（百分比）即n（%）形式表示，组间比较行χ2检验。采用Pearson 法分析支气管哮喘发作期患儿血清cf-DNA/NETs，IL-4 水平与中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及肺功能指标FEV1%，FEV1/FVC 水平相关性。

2 结果

2.1 不同中医证型患儿及健康儿童血清cf-DNA/NETs 及中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞水平比较 见表2。单因素方差分析及SNK-q检验所示，健康对照组、虚喘证组、寒喘证组和热喘证组患儿血清cf-DNA/NETs 及外周血中性粒细胞、单核细胞水平依次升高，淋巴细胞水平依次降低，两两比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 不同中医证型患儿及健康儿童血清cf-DNA/NETs 及中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞水平比较（±s）

表2 不同中医证型患儿及健康儿童血清cf-DNA/NETs 及中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞水平比较（±s）

注：与健康对照组比较，aP ＜0.05；与虚喘证组比较，bP ＜0.05；与寒喘证组比较，cP ＜0.05。

项 目 热喘证组（n=37） 寒喘证组（n=28） 虚喘证组（n=33） 健康对照组（n=25） χ2/F P cf-DNA/NETs（ng/ml） 1 023.51±100.52abc 845.38±83.29ab 694.05±75.93a 2.56±0.75 895.500 0.000中性粒细胞（×109/L） 79.04±5.27abc 71.95±5.46ab 65.49±5.76a 60.81±5.92 63.250 0.000淋巴细胞（%） 17.34±5.75abc 22.16±5.84ab 30.19±6.02a 35.03±6.38 53.900 0.000单核细胞（%） 8.73±1.23abc 7.52±1.19ab 5.96±1.25a 5.02±1.51 50.590 0.000

2.2 不同中医证型患儿及健康儿童血清IL-4 表达水平 单因素方差分析四组血清IL-4 表达水平，差异有统计学意义（F=69.585，P=0.000）。SNK-q检验显示，与健康对照组（17.31±1.85ng/L）比较，热喘证组（23.54±1.82ng/L）、寒喘证组（21.69±1.76ng/L）、虚喘证组（18.97±1.94ng/L）患儿血清IL-4 表达水平均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 支气管哮喘发作期患儿血清cf-DNA/NETs 与IL-4 水平相关性 见图1。Pearson 法分析，支气管哮喘发作期患儿血清cf-DNA/NETs 与IL-4 水平呈正相关（r=0.431，P=0.000）。

图1 支气管哮喘发作期患儿血清cf-DNA/NETs 与 IL-4 水平相关性

2.4 不同中医证型患儿及健康儿童肺功能指标水平比较 见表3。单因素方差分析及SNK-q检验所示，健康对照组、虚喘证组、寒喘证组、热喘证组FEV1%，FEV1/FVC 水平均依次降低，两两比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表3 不同中医证型患儿及健康儿童肺功能 指标水平比较（±s，%）

表3 不同中医证型患儿及健康儿童肺功能 指标水平比较（±s，%）

注：与健康对照组比较，aP ＜0.05；与虚喘证组比较，bP ＜0.05；与寒喘证组比较，cP ＜0.05。

组别 n FEV1/% FEV1/FVC/%热喘证组 37 42.07±10.51abc 55.08±8.65abc寒喘证组 28 54.82±14.83ab 64.54±8.72ab虚喘证组 33 68.19±16.05a 78.03±8.95健康对照组 25 95.97±17.65 85.69±8.57 χ2/F — 71.410 75.790 P—0.000 0.000

2.5 支气管哮喘发作期患儿血清cf-DNA/NETs，IL-4 水平与中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及肺功能指标水平相关性 见表4。Pearson 法分析显示，支气管哮喘发作期患儿血清cf-DNA/NETs，IL-4 水平与中性粒细胞水平、单核细胞水平呈正相关（均P＜0.05），与淋巴细胞，FEV1%，FEV1/FVC 水平呈负相关（均P＜0.05）。

表4 支气管哮喘发作期患儿血清cf-DNA/NETs，IL-4水平与中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及肺功能指标水平相关性

3 讨论

支气管哮喘属于慢性气道炎症性疾病，患者临床表现为胸闷、喘息、气促、咳嗽等反复发作，且多于清晨、夜间发作或加剧[11]。支气管哮喘若进展至急性发作期，会导致患儿出现呼吸困难并影响患儿生存[12-13]。中医学中“哮病”即为支气管哮喘，是宿痰内伏于肺，外加饮食、劳倦等诱因引触，致痰阻于气道、肺气上逆且出入为艰[14]。中医辩证分型能够从不同角度分析支气管哮喘患儿症状，有利于病情控制。

中性粒细胞、T 淋巴细胞等炎性细胞分泌炎性因子，导致机体炎症反应增加和气道高反应是支气管哮喘急性发作的主要机制之一[15-16]。NETs 是一种以DNA 为骨架，另包括弹性蛋白酶、组蛋白等重要蛋白组成的网状结构[17]。NETs 可被真菌、细菌、病毒等多种微生物激活，由中性粒细胞分泌并释放到胞外，可消灭病原菌，并介导炎症、氧化应激等[18-19]。研究表明，支气管哮喘患儿外周血中cf-DNA/NETs 水平明显高于健康儿童[20]。本研究结果显示，入组支气管哮喘急性发作期患儿血清cf-DNA/NETs 水平明显升高，与陈凯宇等[20]研究结果相似，表明cf-DNA/NETs 可能通过反映机体免疫炎症损伤程度预示支气管哮喘的发生、发展。

IL-4 主要由活化Th2 细胞分泌，可诱导人B 细胞分化，是反映Th2 细胞功能的标志物。研究表明，支气管哮喘患儿血清IL-4 表达水平明显上调，与机体免疫反应激活及炎症反应增加有关[21]。本研究发现，与健康对照组比较，热喘证组、寒喘证组、虚喘证组患儿血清IL-4表达水平均明显升高，与CUI等[22]研究结果相似，提示IL-4 可能通过诱导B 细胞生成IgE 和血管内皮细胞黏附因子表达，促进嗜酸性粒细胞的选择性聚集，最终导致气道炎症反应加剧。

本研究还发现，支气管哮喘发作期患儿血清cf-DNA/NETs，IL-4 水平与中性粒细胞水平、单核细胞水平呈正相关，与淋巴细胞、FEV1%及FEV1/FVC 水平呈负相关，表明血清cf-DNA/NETs 水平升高可能受中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞水平调控，通过参与机体炎症反应，影响机体肺功能。

研究报道，支气管哮喘的急性发作期在中医证候分型中出现较多的有热喘、寒喘、虚喘等，其中热喘为痰热壅肺、寒喘为风寒袭肺、虚喘为肺肾两虚[14]。热喘证患儿痰鸣如吼、口渴喜饮、舌苔黄腻、弦滑等实热征象较为明显，热喘证患儿血清cf-DNA/NETs，IL-4 水平最高表明该组患儿炎症反应水平也最高，可能与阳盛邪实有关；寒喘证患儿表现为喘憋气逆、寒饮伏肺等征象，其阳盛邪实相比于热喘证患儿较弱；而虚喘证患儿主要是肺气虚累、阳气虚损导致机体抵抗邪气能力减弱，因此与炎症反应关系较其它两种弱。

综上所述，支气管哮喘患儿血清cf-DNA/NETs，IL-4 水平明显升高，且热喘证患儿血清中二者水平最高，其次为寒喘证、虚喘证，二者水平变化可能与不同中医证型存在一定相关性。但由于本研究不同中医证型纳入样本量较少，两因子对不同中医证型评估价值尚需进一步探究。