子宫内膜癌组织中miR-3188和mTOR表达量与预后的相关性研究

陈晓宇，曾庆维，陈红林，李桂荣

（1.开滦总医院林西医院，河北唐山 063000；2.唐山市妇幼保健院，河北唐山 063000）

子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是女性高发的生殖系统恶性肿瘤之一，发病率逐年升高，且发病趋于年轻化[1]。在EC 早期给予手术切除及综合治疗，患者5年生存率较高，但对于进展期或复发转移的患者而言，预后较差，是导致死亡的主要原因[2]。因此，探究EC 复发转移的指标有着重要意义。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）已被证实参与了EC 的发病和进展过程[3-5]。微小核糖核酸-3188（microRNA-3188，miR-3188）可靶向mTOR 参与鼻咽癌[6]、非小细胞肺癌[7]的细胞增殖及化疗耐药等过程，基于此，有理由推测miR-3188 靶向mTOR 参与了EC 的发病和进展过程，或可用于EC 预后评估。目前，鲜有研究分析其与EC 的关系，本研究主要分析miR-3188和mTOR在EC组织中的表达及与预后的关系，以期为EC 预后评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 前瞻性选取2016年1月～2018年4月在开滦总医院林西医院接受手术治疗的EC 患者121 例作为研究对象，年龄42～69（55.85±5.95）岁，其中内膜样癌99 例，浆液性癌15 例，黏液性癌3 例，透明细胞癌4 例；低分化32 例，中分化44 例，高分化45 例；浸润深度≤1/2 肌层51 例，＞1/2 肌层70 例；淋巴结转移19 例；子宫外转移21 例；FIGO 分期Ⅰ期74 例，Ⅱ期23 例，Ⅲ期15 例，Ⅳ期9 例；雌激素受体阳性88 例，孕激素受体阳性86 例。纳入标准：①经病理活组织检查证实为EC；②有保存在液氮罐中完好的EC 组织和癌旁组织（距离癌缘5 cm 及以上）；③临床资料完整，均完成随访。排除标准：①切除EC组织前接受过放、化疗；②伴心肝肾等实质脏器功能严重异常；③其他恶性肿瘤或自身免疫性疾病。本研究受试者均签署了知情同意书，符合《赫尔辛基宣言》，经开滦总医院林西医院医学伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 752 型紫外分光光度计（上海光学仪器五厂有限公司），CFX96 型实时荧光定量PCR 仪（美国伯乐公司），TRIzol 试剂和逆转录试剂盒（德国罗氏公司），miR-3188 和内参U6 引物（上海吉玛制药技术有限公司），兔抗人mTOR 单克隆抗体和山羊抗兔二抗（台湾亚诺法生技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 miR-3188 表达量检测：用实时荧光定量PCR法[8]检测组织中miR-3188 表达量。步骤如下：①取组织，剪碎，用TRIzol 试剂提取总RNA；②用紫外分光光度计检测RNA 纯度，吸光度值比（A260nm/280nm）在1.9～2.0；③用逆转录试剂盒将RNA 逆转录成cDNA；④用实时荧光定量PCR 仪扩增cDNA，扩增条件为95 ℃ 5 min，40 个循环，95℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。miR-3188上游序列：5’-AGAGGCUUUGUGCGGAUACGGGG-3’，下游序列 ：5’-UCUCCGAAACACGCCUAUGCCCC-3’；内参U6上游序列：5’-GCTTCGGCAGCACATATAC TAA-3’，下游序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCG T-3’。用2-ΔΔCt计算miR-3188 表达量。

1.3.2 mTOR 表达量检测：用蛋白质免疫印迹法[9]检测组织中mTOR 表达量。①取实验1.3.1 中剪碎的组织，用RIPA 裂解液裂解组织细胞，4℃ 4 000 r/min 离心15 min，提取上清液，BCA 法蛋白定量；②用10g/dl SDS-PAGE 凝胶电泳80V 15 min，加压120V 至溴酚蓝跑出胶面，300 mA 60 min 转膜，5 g/dl 脱脂牛奶摇床孵育1 h；③滴加兔抗人mTOR单克隆抗体，4℃下孵育过夜；滴加山羊抗兔二抗，摇床孵育1 h；④ECL 发光液显影。用Image J 1.8.0软件读取凝胶图像。

1.3.3 随访：用门诊复诊方式进行随访，每3 ～6个月随访1 次，了解EC 复发转移及死亡等情况。本研究随访终点为发生EC 复发转移及因复发转移死亡或至末次随访结束（末次随访时间为2021年4月22日），中位随访时间为36（10～36）个月。

1.4 统计学分析 用SPSS 25.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，组内比较用配对样本t检验，两组间比较用独立样本t检验；多组间比较用F检验，组间两两比较用SNK-q检验。计数资料用n（%）表示，组间比较用χ2检验。用COX 回归分析EC 预后的风险因素。用Pearson 相关分析miR-3188 与mTOR 的相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-3188 和mTOR 在EC组织和癌旁组织中的表达 EC 组织中miR-3188 相对表达量低于癌旁组织（0.60±0.14 vs 1.46±0.14），EC 组织中mTOR 相对表达量高于癌旁组织（0.92±0.11 vs 0.63±0.11），差异均有统计学意义（t=48.995，19.348，均P=0.000）。

2.2 miR-3188 和mTOR 与EC 临床病理参数的关系 见表1。不同年龄、是否绝经、不同病理类型、是否雌激素受体阳性及是否孕激素受体阳性的miR-3188 和mTOR 相对表达量比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。不同浸润深度、是否淋巴结转移、是否子宫外转移、不同分化程度及不同FIGO 分期的miR-3188 和mTOR 相对表达量比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 不同临床病理参数miR-3188 和mTOR 相对表达量比较（±s）

表1 不同临床病理参数miR-3188 和mTOR 相对表达量比较（±s）

项 目 n miR-3188 相对表达量 t/F P mTOR 相对表达量 t/F P年龄（岁） ≤60 54 0.61±0.13 0.472 0.638 0.91±0.11 0.723 0.471 ＞60 67 0.60±0.14 0.92±0.10 绝经 否 35 0.61±0.13 0.668 0.505 0.89±0.11 1.976 0.050 是 86 0.60±0.14 0.93±0.10病理分型 内膜样癌 99 0.60±0.14 0.330 0.803 0.92±0.11 0.882 0.453 浆液性癌 15 0.61±0.13 0.90±0.09 黏液性癌 3 0.52±0.13 0.84±0.17 透明细胞癌 4 0.60±0.18 0.90±0.10浸润深度 ≤1/2 肌层 51 0.65±0.12 3.705 0.000 0.88±0.11 3.707 0.000 ＞1/2 肌层 70 0.56±0.14 0.95±0.10淋巴结转移 否 102 0.63±0.13 8.611 0.000 0.90±0.10 6.677 0.000 是 19 0.44±0.08 1.01±0.06子宫外转移 否 100 0.63±0.13 6.429 0.000 0.90±0.10 6.420 0.000 是 21 0.45±0.08 1.01±0.07雌激素受体 阳性 88 0.61±0.14 0.618 0.538 0.92±0.11 1.114 0.268 阴性 33 0.59±0.12 0.90±0.09孕激素受体 阳性 86 0.59±0.15 1.064 0.290 0.93±0.10 1.937 0.055 阴性 35 0.62±0.11 0.89±0.11分化程度 低分化 45 0.56±0.13 2.440 0.016 0.95±0.12 2.400 0.018 中、高分化 76 0.62±0.14 0.90±0.10 FIGO 分期 Ⅰ+Ⅱ 97 0.64±0.12 6.898 0.000 0.89±0.10 7.017 0.000 Ⅲ+Ⅳ 24 0.45±0.08 1.01±0.07

2.3 未复发组和复发组的miR-3188 和mTOR 相对表达量比较 未复发组的miR-3188 相对表达量高于复发组（0.66±0.11 vs 0.45±0.08），mTOR 相对表达量低于复发组（0.88±0.10 vs 1.02±0.06），差异均有统计学意义（t=11.220，9.229，均P=0.000）。

2.4 EC 预后的风险因素分析 见表2、表3。将EC 预后作为因变量，将年龄、绝经、病理类型、分化程度、FIGO 分期、雌激素受体、孕激素受体、miR-3188 和mTOR 作为自变量，分别纳入COX回归分析，结果显示分化程度、FIGO 分期、miR-3188 和mTOR 与EC 预后有关（均P＜0.05）。将EC 预后作为因变量，将分化程度、FIGO 分期、miR-3188 和mTOR 作为自变量，一并纳入COX回归分析，结果显示分化程度高、miR-3188 表达量高是EC 预后的独立保护因素（均P＜0.05），FIGO 分期高、mTOR 表达量高是EC 预后的独立危险因素（均P＜0.05）。

表2 赋值情况

表3 EC 预后风险因素的COX 回归分析

2.5 miR-3188 与mTOR 的关系 见图1。Pearson相关分析结果显示EC 组织中miR-3188 相对表达量与mTOR 相对表达量呈负相关关系（r=-0.409，P=0.000）。

图1 miR-3188 与mTOR 的散点图

3 讨论

目前，关于EC 发病的病理生理机制仍未完全阐明，高发病率、高复发率仍是其主要特征[10-11]。探究预示EC 预后的指标有着重要意义。目前，已有报道[12]证实miR-3188 与EC 细胞对沙利霉素的敏感性有关，其或可用于EC 预后评估。既往关于mTOR 与EC 的研究主要着重于其调节EC 进展的机制及在EC 组织中的表达情况，但关于其表达量对预后的预示作用鲜有研究。本研究主要从分子生物学角度分析与EC 有关的生物标志物miR-3188 和mTOR 与预后的关系，以期为EC 预后评估提供参考。

本研究结果显示EC 组织中miR-3188 相对表达量低于癌旁组织，EC 组织中mTOR 相对表达量高于癌旁组织，上述结果提示miR-3188 和mTOR参与了EC 的发病和进展过程，是EC 预后评估的潜在生物标志物。进一步分析二者与EC 临床病理参数的关系，结果显示不同浸润深度、是否淋巴结转移、是否子宫外转移、不同分化程度及不同FIGO 分期的miR-3188 和mTOR 相对表达量差异均有统计学意义（P<0.05），该结果提示miR-3188和mTOR 与EC 进展有关，可能通过参与EC 肌层浸润、淋巴结转移、子宫外转移及肿瘤分化影响预后。本研究比较了EC 未复发组和复发组的miR-3188 和mTOR 相对表达量，结果显示未复发组的miR-3188 相对表达量高于复发组，mTOR 相对表达量低于复发组，该结果进一步证实miR-3188 和mTOR 与EC 预后有关，或可辅助用于临床医师对EC 治疗及预后管理做出有效决策。

既往研究[6-7,13-14]显示miR-3188参与了鼻咽癌、非小细胞肺癌、乳腺癌及肝细胞肝癌进展，且在鼻咽癌和非小细胞肺癌中已被证实可调控mTOR 参与肿瘤进展。本研究中COX 回归分析结果显示miR-3188 表达量高是EC 预后的独立保护因素，mTOR表达量高是EC 预后的独立危险因素，推测其原因是mTOR 在EC 组织中表达上调，其通过调节EC细胞增殖、侵袭和转移等影响预后[15-17]；而miR-3188 在EC 进展过程中通过靶向mTOR 抑制EC 细胞增殖、侵袭和转移，EC 组织中miR-3188 表达量可反映其对mTOR 的抑制程度，进而反映EC 预后。Pearson 相关分析结果显示EC 组织中miR-3188 相对表达量与mTOR 相对表达量呈负相关，该结果进一步证实了miR-3188 可能靶向mTOR 参与了EC发病和进展过程。此外，本研究中COX 回归分析结果还显示分化程度高是EC 预后的独立保护因素，FIGO 分期高是EC 预后的独立危险因素，该结果与既往研究[18-20]结果一致。

本研究尚存在一定不足，一是随访时间偏短，仅分析了miR-3188 和mTOR 与EC 近期预后的关系，关于二者与EC 远期预后的关系未能进行分析；二是未开展基础研究证实miR-3188 是否靶向mTOR 影响EC 预后；三是关于血液中的miR-3188 和mTOR与EC 预后的关系未进行分析，下一步将针对上述不足进行补充，以期为EC 预后评估添砖加瓦。

综上所述，EC 组织中miR-3188 表达量低、mTOR 表达量高与预后不良有关。