GPRC5A对肝癌细胞增殖、凋亡和氧化应激的影响及作用机制探讨

陈 偲，王 颖，谢生茂，李忠辉，武建军

（1.解放军联勤保障部队第九六九医院消化内分泌科,呼和浩特 010010; 2.内蒙古包钢医院a.老年病科; b.肿瘤内科，内蒙古包头 014010; 3. 内蒙古自治区人民医院消化内科，呼和浩特 010010 ）

近年随着基因分子生物学的研究进展，人们发现肿瘤的发生发展机制复杂，涉及原癌基因的激活和抑癌基因的失活及众多信号分子通路，基于分子生物学的研究为肿瘤的研究及诊治提供了新的方向和思路[1]。G 蛋白偶联受体家族C 群5 成员A（G protein coupled receptor C type group 5 member A，GPRC5A）是3-G 蛋白偶联受体家族的成员，以往研究发现GPRC5A 在多种恶性肿瘤中表达失调，提示GPRC5A 可能参与肿瘤的进展。GPRC5A 的作用首次在肺癌中被揭示，认为是一种促进生长的基因和一种新的p53 转录靶点[2]。且研究表明，与邻近正常组织相比，肺肿瘤组织中GPRC5A 表达下调[3]，其在肺腺癌中发挥抑癌作用。而在乳腺癌中发现GPRC5A 基因具有高突变率[4]。另据报道显示，信号传导转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在众多癌细胞中表达显著上调，能够促进癌症的发生发展。研究表明，敲除STAT3 能够通过刺激肿瘤细胞产生Ⅰ型干扰素，提高免疫原性化疗的疗效[5]。STAT3 在多种癌症中的表达及功能已被证实，GPRC5A 和STAT3 表达具有相关性[6]。且证实，GPRC5A 在结直肠癌组织中高表达，正向调控STAT3 表达，与结直肠癌临床病理关系密切[6]。提示GPRC5A 在肿瘤发生发展过程中发挥某种作用。因此，本研究拟探究GPRC5A 在肝癌中的表达及其对肝癌细胞增殖、凋亡及氧化应激的影响，以期为临床提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2018年12月～2019年11月在本院行手术治疗的38 例肝癌患者癌组织及其对应癌旁正常组织样本，均经临床病理确诊。人正常肝上皮细胞株HL-7702 和人肝癌细胞株（HepG2，HCCLM3，HuH-7 和MHCC-97H）均购自中国科学院细胞库。

1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清、RPMI1640 培养液购自Biological Industries 公司；反转录试剂盒、Trizol 试剂盒购自大连Takara 公司；LipofectamineTM2000 购自美国Invitrogen 公司；实时荧光定量PCR 仪购自Life technologies 公司；BCA 检测试剂盒、Transwell 小室购自Thermo Fisher Scientific 公司；兔抗鼠GPRC5A 单抗、兔抗鼠VEGF 单抗、兔抗鼠caspase-3 单抗、兔抗鼠STAT3 单抗、兔抗鼠c-MYC 单抗、兔抗鼠Socs3 单抗和鼠抗GAPDH购自美国Abcam 公司；阴性对照pcDNA3.1 质粒，pcDNA3.1-GPRC5A 质粒及PCR 引物由武汉金开瑞生物工程有限公司设计合成；酶标仪购自DR-200Bs Diatek 公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 : 将实验肝癌细胞置于含10ml/dl胎牛血清及双抗RPMI1640 培养液常规培养，37 ℃，5ml/dl CO2培养箱孵育，待细胞融合至85%左右时进行传代培养，用于后续实验。

1.3.2 细胞转染: 按照Lipo 2000 试剂盒说明书将阴性对照pcDNA3.1 和pcDNA3.1-GPRC5 质粒分别转染至HepG2 细胞，37 ℃，5ml/dl CO2培养48 h，检测转染效率，实验重复三次。分组：根据转染情况分为空白对照组（control 组），pcDNA3.1（对照pcDNA3.1 组），pcDNA3.1-GPRC5（pcDNA3.1-GPRC5A 过表达组）。

1.3.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验：采用Trizol 法提取细胞总RNA，通过逆转录试剂盒反转录为cDNA，以此为模板配置PCR 扩增反应体系行qRT-PCR 实验，以β-actin 为内参，检测GPRC5A 相对表达。引物序列如下，GPRC5A 正向：5’-AGCAGGTCTCATCGCAGCTT-3’，反向：5’-ACTTGCGAATCATACGCACG-3’；β-actin 正向：5’-CTGACGATCGATAGTCATATGGC-3’，反 向：5’- agCatacGttGtCacGactCc-3’。2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达。

1.3.4 蛋白免疫印迹（Western blotting）实验：取对数生长期HepG2 细胞接种于25 cm2培养皿，待细胞融合至80%～90%时进行细胞转染。48 h 后收集各组细胞，加入RIPA 裂解液于冰上裂解，采用BCA 法测定蛋白浓度；取20 mg 蛋白样品行SDSPAGE 凝胶电泳，转移至PVDF 膜，5g/dl 脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗孵育过夜；次日，TBST 洗膜3次，加HRP 标记二抗，孵育2 h；TBST 洗膜3 次，ECL 显色观察。

1.3.5 MTT 细胞增殖实验: 取对数生长期HepG2细胞接种于96 孔板，浓度6×105个/孔，培养4h后每孔加入MTT 溶液10 μl，继续孵育4 h，采用酶标仪测量570 nm 处吸光度值。实验重复3 次。

1.3.6 V-FITC/PI 细胞凋亡检测 ：将pcDNA3.1-GPRC5A 或空载pcDNA3.1 质粒分别转染在HepG2细胞，37 ℃，5ml/dl CO2培养48 h；收集细胞接种在6 孔板，浓度1×106个/孔，根据V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒说明书进行检测，流式细胞仪分析细胞凋亡率。实验重复3 次。

1.3.7 细胞氧化应激检测：待细胞转染后用于以下实验检测：①ROS 含量检测：以1×106个/孔接种在6 孔板，48 h 后收集细胞，加入10 μmol/L DCFH-DA 重悬，根据ROS 检测试剂盒说明书进行检测。②NAD+/NADH 检测：以同样密度接种于96 孔板，48 h 后收集提取细胞蛋白，按照NAD+/NADH 试剂盒说明书配制检测液，并加入配置好的样本液，37℃避光孵育1 h，检测450 nm 处吸光度值。③ATP 含量检测：以同样密度接种于96 孔板，48 h 后收集提取细胞蛋白；按ATP 检测试剂盒说明书配制检测液，加入50 μl 样本液，避光孵育30 min，检测450 nm 处吸光度值。实验重复3 次。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0 进行数据分析，数据采用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用one-way ANOVA分析，组间两两比较采用LSD-t检验。肝癌组织及癌旁正常组织中表达差异采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GPRC5A 在肝癌组织及细胞中的表达 qRTPCR 法检测肝癌组织、配对正常组织和肝癌细胞、肝正常上皮细胞中GPRC5A 表达，结果显示肝癌组织中GPRC5A 表达量（0.34±0.09）显著低于癌旁正常组织（0.73±0.10），差异有统计学意义（t=17.869，P<0.01），见图1A；类似地，GPRC5A 在肝癌细胞

HepG2（0.35±0.06），HCCLM3（0.38±0.10），HuH-7（0.53±0.07） 和MHCC-97H（0.67±0.06）中的表达量均显著低于人正常肝上皮细胞HL-7702中的表达量（1.00±0.08），差异均有统计学意义（t= 11.258，8.386，7.658，5.716，P<0.05，见图1B），其中HepG2，HCCLM3 细胞中表达最低。因此选择HepG2 细胞进行后续实验。

图1 GPRC5A 在肝癌组织和细胞中的表达量

2.2 GPRC5A 过表达对肝癌细胞增殖的影响 经实验检测显示，与对照组（1.00±0.10）和pcDNA3.1组（1.02±0.08）相比，转染pcDNA3.1-GPRC5A组（2.49±0.22）细胞中GPRC5A 表达水平显著增加（F=101.421，P<0.001），见图2A 和2B。转染pcDNA3.1-GPRC5A 组（0.94±0.16）36 h 的细胞增殖A值较对照组（1.49±0.05）和pcDNA3.1 组（1.45±0.07）显著降低（F=25.640，P<0.01），见图2C。GPRC5A 过表达组（0.98±0.04）细胞上皮增长因子VEGF 表达量较Control 组（2.94±0.15）和pcDNA3.1 组（2.89±0.11）也显著降低（F= 310.450，P<0.001），见图2A 和2B。以上结果说明过表达GPRC5A抑制了肝癌HepG2细胞的增殖。

图2 过表达GPRC5A 抑制肝癌细胞的增殖

2.3 GPRC5A 过表达对肝癌细胞氧化应激和凋亡的影响 经检测显示，转染pcDNA3.1-GPRC5A 组（182.12±13.42）细胞中氧化应激相关因子ROS水平较对照组（101.23±11.20）和pcDNA3.1 组（98.30±10.26）显著增加（F=49.577，P<0.001）；NAD+/NADH（35.24±6.43） 及ATP（55.34±6.51）水平较对照组（100.25±12.41，100.17±14.36）和pcDNA3.1 组（97.86±9.67，102.23±11.02）显著降低（F=42.338 和17.077，P<0.05），见图3A。GPRC5A过表达组（20.70%）细胞凋亡率较对照组（4.70%）和pcDNA3.1 组（5.00%）显著提高，见图3B。细胞凋亡蛋白caspase-3（2.61±0.16）表达量较对照组（1.00±0.11）和pcDNA3.1 组（1.01±0.02）也显著增加（F=202.843，P<0.001），见图3C。以上结果说明过表达GPRC5A 促进了HepG2，HCCLM3 细胞的氧化应激，并诱导细胞凋亡。

图3 过表达GPRC5A 诱导肝癌细胞的氧化应激和凋亡

2.4 GPRC5A 对STAT3/Socs3/c-MYC 信号通路相关蛋白表达的影响 研究通过转染过表达肝癌细胞中GPRC5A 表达发现，与对照组（1.00±0.13）和pcDNA3.1 组（1.03±0.12）相比，转染pcDNA3.1-GPRC5A 组（0.43±0.06）细胞中p-STAT3 表达量显著降低（F=29.476，P<0.001），见图4A 和4B；pcDNA3.1-GPRC5A 组下游基因Socs3（0.47±0.05），c-MYC（0.54±0.06）表达量显著低于对照组（1.01± 0.05，1.00±0.04） 和pcDNA3.1 组（0.98±0.09，1.02±0.06）（F=63.275，75.409，均P<0.001），见图4A，4C 和4D。进一步研究发现，肝癌组织中STAT3 与GPRC5A 表达量呈显著负相关（r=-0.746，P<0.01），见图4E。以上结果说明过表达GPRC5A抑制STAT3 的表达，并抑制Socs3/c-MYC 通路的激活。

图4 过表达GPRC5A 抑制STAT3/Socs3/c-MYC 信号通路激活

2.5 STAT3 介导的Socs3/c-MYC信号通路参与GPRC5A 对肝癌细胞的作用机制 为探究GPRC5A与Socs3/c-MYC 信号通路在肝癌中作用机制，研究在HepG2 细胞中分别转染pcDNA3.1-GPRC5A，pcDNA3.1-STAT3 或pcDNA3.1-NLRP3，经检测发现，转染pcDNA3.1-STAT3 或pcDNA3.1-NLRP3显著促进细胞内VEGF 蛋白表达（P<0.05），见图5A；抑制细胞凋亡率（P<0.05），见图5B；增加细胞内IL-6 水平（P<0.05），见图5C；细胞内ROS 水平明显降低（P<0.05），见图5D，显著逆转了pcDNA3.1-GPRC5A 的抑制作用。以上结果表明STAT3 介导的Socs3/c-MYC 信号通路参与GPRC5A 对肝癌细胞的作用机制。

图5 STAT3 介导的Socs3/c-MYC 信号通路抑制卵巢癌细胞的氧化应激和凋亡

3 讨论

肝癌是临床常见的恶性肿瘤，高死亡率，是全世界癌症相关死亡率的第三大常见原因。近年研究发现，遗传、表观遗传改变、慢性乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染、黄曲霉毒素、吸烟、肥胖和糖尿病等是肝癌的主要危险因素[7-8]。高复发率、高转移率是肝癌患者预后差的主要原因[9]。因此，基于分子生物学角度找寻特异性分子靶标对肝癌临床诊治及攻克具有显著意义。

研究发现，GPRC5A 异常表达与恶性肿瘤发生发展密切相关[10]。GPRC5A 在肺组织中异常低表达，参与肺癌的发生发展进程[3]。GPRC5A 通过激活表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号导致MDM2 失调，促进肺肿瘤的发展[11]。GPRC5A 通过调节细胞周期促进前列腺癌细胞增殖和转移[12]。GPRC5A 通过介导细胞氧化应激反应促进了喉癌的进展[13]。提示GPRC5A 在人类恶性肿瘤发生发展中扮演原癌或抑癌基因作用。而本研究检测表明GPRC5A 在肝癌组织和细胞中显著低表达，GPRC5A 过表达显著抑制了肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡和氧化应激。

最近研究表明，GPRC5A 功能障碍发生在多种与人类癌症相关的途径中，包括NF-κB，FAK/SCR 和STAT3 途径[3]。STAT3 被认为是癌症治疗的重要靶点，易在各种恶性肿瘤中被激活[14]。研究发现，化合物K 通过调控STAT3 诱导人肝癌细胞内质网应激和凋亡[15]。MEST 通过STAT3 激活诱导乳腺癌中twist-1 介导的EMT，STAT3，Twist 和EMT标记物可作为防治乳腺癌的潜在分子靶点[16]。此外，BRM 转录调控miR-302a-3p 靶向SOCS5/STAT3 信号轴，增强胰腺癌转移[17]。GPRC5A 过表达抑制了IL-6 诱导的STAT3 活化，抑制了细胞生长，阻止了头颈部鳞状细胞癌的进一步恶化。同样，在本研究中探究发现GPRC5A 抑制了STAT3的表达，而STAT3 促进了肝癌细胞的增殖，两者表达呈显著负相关，这表明STAT3 在促进肝癌的发展中起着重要作用。

据报道，IL-6 激活的STAT3/Socs3 轴促进了肿瘤的发生发展[18]。研究发现，MiR-203 通过靶向SOCS3 调控JAK-STAT 通路影响胰腺癌细胞增殖和凋亡[19]。认为STAT3 和SOCS3 之间存在负反馈，这可能通过抑制特异性细胞因子和凋亡信号的产生在T 细胞淋巴瘤中发挥致癌作用。此外，STAT3和c-MYC 在人胃癌组织和细胞中上调，c-MYC 的敲除抑制胃癌细胞的增殖和糖酵解，提示STAT3/c-MYC 可能是胃癌潜在的治疗靶点[20]。本研究发现，GPRC5A 过表达能够下调STAT3 及下游基因Socs3，c-MYC 表达量，抑制Socs3/c-MYC 通路激活，当同时共转染pcDNA3.1-STAT3 或pcDNA3.1-NLRP3 时，GPRC5A 过表达对肝癌细胞的作用被完全逆转，提示STAT3 介导的Socs3/c-MYC 信号通路参与GPRC5A 对肝癌细胞的作用机制，靶向STAT3/Socs3/c-MYC 通路可能是肝癌潜在的肿瘤治疗方法。本研究初步探明了GPRC5A 对肝癌细胞生物学行为及氧化应激的影响，揭示了其在肝癌发生发展中的表达作用机制，为临床肝癌的研究治疗提供了新的分子靶标，具有可推广性。然而肿瘤发生的机制复杂，其中涉及分子通过的异常激活或失活，本研究虽证实GPRC5A 通过调控STAT3 介导的Socs3/c-MYC 信号通路发挥作用，但其更深入的调控机制还需进一步探究阐明。

综上所述，肝癌细胞中GPRC5A 显著低表达，GPRC5A 过表达能够抑制肝癌细胞增殖，诱导细胞氧化应激及凋亡，其通过调节STAT3 介导的Socs3/c-MYC 信号通路和NLRP3 炎症小体参与调控肝癌的发生发展，提示GPRC5A 可作为新的与肝癌细胞增殖、氧化应激和凋亡相关的生物标志物。进一步探究GPRC5A 的功能作用，有助于为人类恶性肿瘤的治疗找寻新的治疗途径。