基于SYRCLE风险评价工具及实验研究报告规范评价电针干预脊髓损伤后神经源性膀胱动物实验报告质量

王瑞奇黄春华吴清忠刘浪辉官磊瑶徐 添

(1.江西中医药大学研究生院,南昌 330006;2.江西中医药大学附属医院,南昌 330006)

脊髓损伤(spinal cordinjury,SCI)是一种有较高发病趋势的严重的创伤性神经系统疾病,不仅严重影响患者的生活质量,而并具有高致残、高致死的临床特征[1]。神经源性膀胱(neurogenic bladder,NGB)是SCI所引起的最重要的并发症之一,有超过80%的SCI后患者出现不同程度的膀胱功能障碍,主要表现为尿失禁和尿潴留[2],使得罹患此病的患者受尽百般折磨,也给患者及其家庭带来了沉重的负担。尿液的储存和排尿是一个复杂的过程,需要脊髓整合来自大脑、膀胱和尿道的信息,当脊髓损伤时,使与控制排尿有关的中枢神经系统或周围神经受到损害而出现膀胱或尿道的功能障碍,脊髓损伤发生在骶上段则表现为尿失禁,发生在骶段,表现为尿潴留。若膀胱不能有效排空,会带来更加严重的后果,如尿路感染,尿路结石,慢性肾功能衰竭和尿毒症等[3]。

目前对于NGB的治疗多数研究侧重于通过清洁间歇性导尿,药物和外科手术等治疗手段,但是,这些治疗方法并不令人满意。反复多次采用清洁的间歇性导管插入术来促进排尿,这可能导致反复的尿路感染并降低生活质量[4]。长期使用抗胆碱能药物,可能会导致口干、便秘、视力模糊、嗜睡以及皮肤和粘膜干燥等副作用[5]。此外,对于NGB所采用的外科手术,如扩大膀胱成形术,可能会解决与膀胱容量有关的问题,但会导致尿路感染、尿路结石症和其他并发症[6]。当前已有大量的临床研究及系统评价报道电针治疗NGB取得了很好的疗效[7-9],因其操作简便、毒副作用少等优势而在临床广泛应用。有研究表明,电针能够加强对腹下神经、盆神经和阴部神经的刺激,被动地引起膀胱内括约肌、逼尿肌的节律性收缩,促进排尿反射的建立[10]。而且能够促进神经修复、改善损伤区微环境、抑制神经细胞凋亡[11]。因此,有不少研究人员通过基础实验来探索电针治疗SCI后NGB的内在机制。

动物实验在基础研究中扮演非常重要的角色,在进行临床试验之前,治疗方法的安全性和有效性通常需要先在动物模型上进行测试,其结果对下一步设计和实施临床研究具有重要的参考价值。但如果动物实验方法学质量存在缺陷,就很有可能导致其研究结果不科学、不准确,报告不完整、不规范会使读者无法真正了解研究的真实性和实用性[12-13]。随着动物实验的广泛开展,动物实验报告不规范或不充分的问题逐渐得到重视。SYRCLE动物实验风险评估工具(SYRCLE’s risk of bias tool for animal studies)是2014年动物实验系统评价研究中心的Hooijmans等多名学者基于Cochyane风险评估工具所制定的,以提高动物实验的方法质量及研究过程的透明化。2010年先后发表了ARRIVE指南(animal research:reportingin vivoexperiments guidelines)[14]和GSPC清 单(gold standard publication checklist)[15],为撰写和发表动物实验报告提供了写作指南和参考清单,确保动物实验所提供的信息能够被充分评估和利用[13]。然而国际实验动物中心研究人员发现很多实验人员对ARRIVE 2010中很多条目无法正确理解,甚至认为指南中诸多条目与自己实验无关,可能导致动物实验报告的不完整性[16-17]。因此Sert等[18]对ARRIVE 2010进行修订,对所有条目的重要性的先后顺序做出说明,2019年在线发布了ARRIVE 2019。因此,本研究旨在通过SYRCLE风险评价工具及实验研究报告规范(ARRIVE 2019指南和GSPC清单)评价当前电针干预治疗SCI后NGB动物实验的报告质量,发现和总结目前在动物实验报告方面存在的问题,并且希望以此引起研究人员对动物报告指南的重视,能够进一步改进动物实验的设计、实施与报告规范,提高动物研究的严谨性和可重复性。

1 材料和方法

1.1 纳入标准

研究对象:脊髓损伤后神经源性膀胱的动物实验,实验动物包括鼠、兔、狗等;研究类型:动物实验的随机对照试验,语言仅限中、英文;干预方式:试验组单用电针治疗,对照组治疗措施不限。

1.2 排除标准

非脊髓损伤引起的神经源性膀胱,如糖尿病、中风后或盆腔术后等;实验组非单纯使用电针治疗的动物实验;非动物实验,如理论研究、临床研究、综述、经验个案等;重复发表的文献(如:同一作者同一研究切实验结果相同发表在国内不同杂志、在国内外同时发表或者发表在同一杂志被不同数据库收录)仅取1篇。

1.3 检索策略

计算机检索中国知网、万方、维普、中国生物医学文献数据库、PubMed、Web of science和Cochrane library等数据库。中文检索词为“电针”、“针灸”、“针”、“神经源性膀胱”、“尿潴留”、“脊髓损伤”、“排尿 障 碍”、“鼠”、“兔”等。英 文 检 索 词 为“electroacupuncture”、“acupuncture”、“needle”、“neurogenic bladder”、“urinary retention”、“spinal cord injury”、“mouse”、“mice”、“rabbit”等。检索日期为2010年1月1日至2020年10月28日。检索词采用主题词和自由词相结合,并手动检索相关参考文献。

1.4 文献质量评价方法

采用SYRCLE动物实验风险评估工具进行方法学质量评估,采用ARRIVE 2019指南的21个条目39个亚条目和GSPC清单的10个条目的54个亚条目对纳入研究进行评价。由2位评价人员根据SYRCLE动物实验风险评估量表、ARRIVE指南和GSPC清单的每一个条目分别对纳入研究进行评价,其中SYRCLE动物实验风险评估工具通过参考陶功财等[19]对本评估量表的解读进行评价,若研究采用合理的方法降低偏倚风险则评价为“低风险”,若研究提供的信息不充分,无法评估其偏倚风险则评价为“不确定风险”,若研究采用了错误的方式增加了偏倚风险发生的可能性则评价为“高风险”[20]。同时对每个条目进行赋分,“低风险”2分,“不确定风险”1分,“高风险”0分,最后计算每项研究的总分。ARRIVE 2019指南和GSPC清单根据文献对每个亚条目的符合情况作出“高风险”、“中等风险”、“低风险”的判断,“低风险”是指待评价文献详细地报告了该亚条目所涉及的全部信息,“中等风险”指待评价文献仅部分提及亚条目信息,“高风险”指待评价条目未涉及亚条目的具体信息。在进行前,2名评价人员需进行集中培训,明确并统一各个条目的评价标准,当遇分歧时交由第3名评价人员(黄春华副主任中医师)进行仲裁,具体统计结果见表1～表4。

1.5 统计学方法

所有评价条目结果均在Excel 2019中进行统计分析,计数资料采用例数和百分比(%),采用Stata 14.2软件进行数据分析,结局指标为连续变量则采用SMD和95%可信区间(CI)表示。进行异质性检验,若无明显异质性(I2＜50%,P＞0.10),选择固定效应模型;反之则选择随机效应模型。

2 结果

2.1 文献筛选结果

初步筛选出1423篇文献,将其导入Note Express 3.2.0中剔除543篇重复文献,剩余880篇,进一步阅读题目、摘要及全文进行筛选,排除非动物实验类研究345篇,非脊髓损伤损伤后NGB 291篇,其他疗法或联合治疗211篇,重复发表研究6篇,无法获取全文1篇,最终纳入26篇[21-46],包括25篇中文文献,1篇英文文献,其中6篇学位论文,20篇期刊文献。

2.2 SYRCLE风险评价工具评估结果

SYRCLE动物实验偏倚风险评估工具是目前唯一专门针对动物实验内在真实性评估的工具[47],是在Cochrane偏倚风险评估工具的基础上建立的,共包括10个条目,其中基线特征、动物安置随机化、随机性结果评估为新增条目。如表1所示,在10个条目中:(1)分配序列:有18项(69.2%)研究使用“随机数字表法”进行分组,评为“低风险”;剩余研究仅提及“随机”而未进行详细说明评为“不确定风险”。(2)基线特征:所有研究仅提及了大鼠的年龄、性别、体重、种类中的一个或多个,而实验中相关结局指标的基线值等均未提供,故均评价“不确定风险”。(3)隐蔽分组:所有研究仅提及“随机”或“随机数字表”,提供的信息不够充分,未能实现随机序列的不可预测性,故评价为“不确定风险”。(4)动物安置随机化:仅有14项(53.85%)的研究表明将大鼠放置在自由饮水,相同温度、湿度等饲养情况相同的环境中单笼喂养,评为“低风险”。(5)、(7)盲法:所有研究均未描述对动物饲养者、研究者和结果评价者施盲,故均评为“不确定风险”。(6)随机结果评估:所有研究均未采用如随机数字表等正确的随机方法选取实验动物用于结果评价,均评为“不确定风险”。(8)不完整数据报告:有21项研究(80.77%)在实验过程中有缺失数据(动物死亡或剔除),但均未对缺失数据是否影响最终结果真实性进行任何说明,故评为“高风险”。(9)选择性结果报告:仅有1项研究将膀胱最大容量设定为需观察的结局指标但未对结果进行报告,评价为“高风险”;其余研究均为出现不完整数据报告,评价为“低风险”。(10)其他偏倚来源:有1项研究用新的大鼠加入到实验以弥补被剔除的死亡大鼠,故评为“高风险”。见表1。

表1 SYRCLE动物实验风险评估工具评估结果Table 1 Evaluation results of SYRCLE animal experiment risk assessment tool

从各研究的总评分看,自2014年制定了SYRCLE动物实验风险评估工具以来,从事电针干预治疗SCI后NGB的研究人员并未对此量表引起重视,未采取恰当措施降低各类偏倚风险,各项目评分没有明显变化,尤其是在“盲法”和“随机性结果评估”方面,仅有18项(69.23%)的研究使用了“随机数字表法”进行分组,虽然从表中可以看出“分配序列”在2013～2019年一直保持在较高水平,然而2020年的6项研究中仅有2项采用“随机数字表法”,因此应该加强和推广SYRCLE动物实验风险评估工具的使用。

2.3 ARRIVE 2019指南评估结果

ARRIVE 2019指南主要用于指导动物实验研究和实验设计,根据最新的ARRIVE 2019指南,将所有条目分为10项必备条目和11项补充条目,共含39个亚条目,详见表2、表3。

表2 ARRIVE 2019指南10项必备条目评价结果Table 2 Evaluation results of 10 essential items of ARRIVE 2019 guide

表3 ARRIVE 2019指南11项推荐条目评价结果Table 3 Evaluation results of 11 recommended items in the ARRIVE 2019 guide

2.3.1 ARRIVE 2019指南10项必备条目

在10个必备条目的23个亚条目中,低风险率为43.14%,中度风险率为26.42%,高风险率为30.43%。其中在研究设计方面:26项研究均能提供简要的研究设计细节。在样本量方面:26项研究均提供了每组的动物数量及总数量,但均未解释样本量的确定方法。在纳入和排除标准方面:26项研究均有描述造模后的排除标准(如死亡、自噬以及膀胱破裂等)但未具体描述如何使用实验数据;有21项研究报道了剔除动物,大多是因死亡、其他并发症或者造模失败;26项研究均给出了各组的样本量。在随机化方面:有18项研究采用随机数字表法,8项研究仅提及随机而未指明方法;26项研究均未采取减少潜在偏倚的措施。盲法方面:仅有2组研究指出采用3人单盲对造模结果进行记录并整理分析,但实验过程及数据分析方面均未施盲。结果测量方面:26项研究均对评估结果的标准进行描述,如尿动力学、基因表达、蛋白表达等,但均未确定用于确定样本量的主要结局指标。统计方法方面:26项研究均只简单的描述了统计方法,所有研究均报告了统计分析中使用的实验单位。实验动物方面:仅有8项研究详细描述了动物品种、年龄、性别和重量等,其余18项研究大多为对动物和年龄和重量有遗漏,26项研究均给出动物来源,而对健康/免疫状况、基因修饰状况等情况未做描述。实验步骤方面:26项研究均记录了操作方法和时间,但对实验的基本原理均未做描述,仅有3项研究记录了操作地点如实验室等。结果方面:26项研究均对每项结局指标的结果进行描述,但均未测量每组实验数据的变异度和置信区间。

2.3.2 ARRIVE 2019指南11项推荐条目

在11项推荐条目的16个亚条目中,低风险率为23.56%,中度风险率为16.83%,高风险率为59.61%。其中在摘要方面:有21项研究能够按指南要求进行描述,有5项研究在实验动物或关键方法方面描述不完全。在背景方面:26项研究均给予了科学的研究背景,然而仅有4项研究对动物模型的选择进行了解释,并且4项研究均为学位论文。在目的方面:仅有7项研究清楚的描述了实验研究问题,研究的主要和次要目的,并提出被验证的具体研究假设。在伦理声明方面:仅有2项研究既提供了动物许可证号又表明通过伦理审查,18项研究仅提供了动物许可证号,6项研究伦理审查、许可证编号均未提供。饲养场所方面:仅有6项研究提供了饲养场所及阳光、温度、湿度等饲养条件的详细信息,9项研究仅简单描述,11项研究未做描述。在动物护理和检测方面:仅有3项研究指出在实验过程中对动物处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》并实施具体缓解痛苦的措施,5项研究仅提及符合《关于善待实验动物的指导性意见》而对采取的措施未做具体描述,18项研究均未提及。在诠释/科学内涵方面:26项研究在解释结果时均对研究目的、假设以及相关研究进行了论述并提供参考文献,仅有6项研究描述了研究的局限性。概括/转换方面:26项研究均未提及研究成果能转化到其他物种或实验条件。注册计划书方面:由于目前未对动物实验进行全面的注册,因此,26项研究均无法获取研究计划书。数据共享方面:26项研究均未说明研究数据是否可用以及在何处可用。利益声明方面:仅有1项研究报告明确指出不存在利益冲突,其余均未描述。7项研究提供了资金来源,但未说明资助者所起到的作用,19项研究无资金来源。

2.4 GSPC清单

GSPC清单重点突出了报告饲养条件和设计动物实验的基本原理,包括10个条目的54个亚条目,低风险率为20.45%,高风险率为24.09%,中度风险率为55.46%。(1)前言部分:有9项研究讲述了当前SCI后NGB的研究进展并提供相关参考文献,指出当前治疗中存在的不足并确立明确的研究目标;26项研究均使用PICO原则;有4项研究提供了选择模型的依据或模型的特异性,且均为学位论文,其余22项研究均未提及。(2)方法部分:26项研究均记录了动物数量、性别、年龄等信息;所有研究均未进行微生物描述,但实验报告中报告了动物的提供方;有12项研究对饲养场所的温度、湿度等条件进行了描述,但未提及加减压、灯光等因素,14项研究未提及饲养场所条件;21项研究提及单笼饲养但未描述原因;有15项研究说明食水自由,无时间限制;26项研究对造模成功的指征及干预措施进行描述;20项研究解释了动物剔除原因;26项研究均未对对照组的重要性进行阐述;仅有2项研究描述了“3人单盲”其余均仅描述了具体结局指标及测量方法。(3)结果方面:26项研究对主要结果及纳入动物或剔除动物等进行了描述,但是对剔除动物调整后所致的影响未做描述。(4)讨论方面:26项研究均对主要结论及发现进行了讨论并对研究结果可能带给临床和整个科学的意义进行阐述。见表4。

表4 GSPC清单评价25篇电针干预SCI后NGB动物实验报告质量Table 4 GSPC checklist evaluates the quality of 25 NGB animal experiment reports after electroacupuncture intervention with SCI

2.5 实验结果系统评价

对纳入的26篇文献的研究结果进行系统评价,对文献中数据进行提取整理,数据相同的研究仅取1篇,由于尿动力学是评估排尿功能障碍患者的重要指标之一,因此结合纳入研究综合考虑以膀胱最大容量、漏尿点压力、膀胱顺应性作为主要观察指标进行分析。其中膀胱最大容量和膀胱顺应性异质性较大,采用随机效应模型进行合并分析,而漏尿点压力采用固定效应模型进行合并分析。使用“去除单项研究法”进行敏感性分析发现,剔除任意1项研究后,结果显示每个独立的研究结果对总体合并效应量无明显影响。表明各研究间具有较高的同质性,所得结论较为可靠。系统评价结果显示电针较模型组可以提高膀胱最大容量[SMD(95%CI)=3.22(2.78,3.66),P=0.00001]和膀胱顺应性[SMD(95%CI)=2.69(2.24,3.14),P=0.00001],降低膀胱漏尿点压力[SMD(95%CI)=-1.59(-1.98,-1.20),P=0.00001]。

续表4

3 讨论

动物实验是连接基础研究和临床试验的桥梁,其设计和实施的质量能够影响众多领域课题研究的成果[20],通过SYRCLE动物实验风险评估量表、ARRIVE指南和GSPC清单对2010年以来公开发表的电针治疗SCI后NGB的实验报告进行全面、系统的分析,我们发现在实验报告方面仍存在诸多问题。(1)纳入研究的实验方法描述不完整,相对于临床研究,“随机化”应更容易在动物实验中实施,但在分组时仅有18项研究说明使用“随机数字表法”进行分组,在结果测量时仅有2项研究提及在检测髓内细胞凋亡情况时“上下随机各取3个切片”,在测量大鼠尿动力学等结果时均未提及随机选取大鼠进行检测。研究表明,大多数动物存在昼夜节律现象,脂质代谢、神经递质水平、药物动力学和其他因素会影响动物的昼夜节律,如果在进行结果评估时没有随机选取动物,则可能产生测量偏倚的风险[48]。(2)24(92.31%)项研究均未实施“盲法”,虽然在实验过程中不需要对动物施盲,但是在干预实施和结果测量的过程中,若未施盲,可能导致预期实验结果产生主观偏倚。在以后的动物实验中,建议研究者应注重采用“盲法”和“随机化”原则的实施,或保持实验组和对照组的结果评估方法不变,并应注意结果评估的随机化,以减少测量偏倚。(3)在纳入研究的研究目标中,所有研究均未分主要结局指标和次要结局指标,导致研究没有侧重点,也未给与确定样本量的方法(算法或公式),样本量不足可能导致假阴性的结果,遗漏一些潜在的重要发现,故非常有必要报告每组有多少动物参与实验,以及实验前用什么统计方法来确定样本量。(4)所有研究均缺乏对动物基线特征的描述,由于动物实验的样本量一般小于临床实验,动物之间的个体差异较大,因此一些重要的基线特征的差异更易影响实验结果的推断。(5)动物的生存环境如温度、湿度和光照等因素均会对实验结果产生重要影响,因此动物实验中对于动物的安置方式也极为重要,仅有53.85%的研究采用了“动物安置随机化”,若未随机安置动物,研究人员可能会对各组动物的行为表现产生一定的预见性,导致实施偏倚。并且在描述动物生存环境时应尽量详细,如环境温度、湿度、光照等做详细描述,仅有12(46.15%)项研究对饲养场所做了部分描述。(6)有80.77%的研究报告有数据的缺失导致样本量的减少但均未分析对剔除动物的处理和实验结果的影响,容易导致实验的不准确性和不可靠性,提示今后的研究者可以参考临床研究中使用的意向性分析法(ITT)等来处理失访数据[49]。由此可见,纳入的电针治疗SCI后NGB的动物实验存在诸多报告信息不完整现象,由于未完整报告相关的重要信息如如何设计、实现和分析动物实验,使读者无法客观、准确地评估该动物实验可能产生的偏倚风险,并且使其他研究者重复实验的可能性降低,会降低实验的参考性,影响实验的可靠性和真实性。通过对所纳入研究的实验结果进行系统评价发现,电针组较模型组能够提高膀胱最大容量和膀胱顺应性,降低膀胱漏尿点压力,以此实现膀胱低压储尿、控制排尿的目的。

ARRIVE 2019指南是在ARRIVE 2010指南的基础上进行调整,将原有的39个亚条目进一步划分为23个必备条目和16个推荐条目,以便让研究人员分清主次,在对必备条目充分报告的前提下对推荐条目进行描述,从分析结果来看,必备条目的中低风险率为69.56%,推荐条目的中低风险率为40.39%,说明研究人员对于必备条目的描述仍不充分。方泽萍等[12]、白哲等[13]通过调查动物实验研究人员、杂志社“约稿”情况以及编辑对ARRIVE指南和GSPC清单的了解情况,发现目前国内期刊“稿约”对ARRIVE指南和/或GSPC清单的引入率为很低,并且在期刊编审人员和实验研究人员中的知晓率较低,导致ARRIVE指南和GSPC清单在实际工作中应用较少,因此在评价时大多数条目均被评为为中高风险。

本研究也存在一定的局限性:(1)本研究分析评价了各大数据库中电针治疗SCI后NGB的实验报告,但仅纳入26篇文章,相对较少,其结果不能代表其他干预方法治疗SCI后NGB及其他领域的实验研究质量;(2)ARRIVE指南和GSPC清单的评估过程具有较强的主观性,不同的评价者对于各条目风险的判断不同,所得结果可能存在差异。

综上所述,我们应采取针对性的措施进一步推广和使用SYRCLE动物实验偏倚风险评价工具、ARRIVE指南和GSPC清单,以有效指导动物实验的设计、实施和报告,最终提升动物实验报告质量并提高动物实验研究的可重复性和实验结果的再现性。