基于Image J软件对BALB/c突变卷毛鼠肝肿瘤的定量分析

李晓娟李兴杰孙慧伟姜棋予柴燕涛高 蓉李 润李瑞生*汤紫荣

(1.解放军总医院第五医学中心感染病医学部,北京 100039;2.解放军总医院第五医学中心住院与病案管理科,北京 100039)

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国乃至全世界最常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年升高,对我国公共卫生事业提出了重大挑战[1]。受到肝癌诊断与临床治疗技术的限制,大多数患者直到发展为进展期或晚期才确诊,肝肿瘤已呈多发或弥散性肿瘤病灶,同时转移与侵袭能力较强[2-3],因此进展期肝癌的各项研究逐渐成为了热点。而动物模型在研究过程中起到非常重要的作用,但目前尚未有最合适的进展期肝癌动物模型,因此需建立更加直观且便捷的动物模型。同时在肝癌建模的评价中,对肿瘤定性研究使用较多,对肿瘤组织等图片进行定量分析则较少见。BALB/c卷毛鼠是本实验室发现的自发突变小鼠,前期研究表明突变基因对该鼠的各个系统尤其是免疫系统产生了一定的影响[4-5]。因此本实验利用BALB/c突变卷毛鼠与正常BALB/c小鼠构建经肝门静脉注射后形成多发与弥散的肝肿瘤病灶,利用Image J软件直观地对两组小鼠的肿瘤病灶比例进行定量分析与对比分析,以期了解突变鼠与正常小鼠在构建进展期肝癌肿瘤模型之间的差异性,为今后更好得开发和利用本突变鼠作为具有优势的进展期肝癌动物模型提供坚实的理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

KM小鼠,3只,SPF级,雌性,6周龄,体重18～20 g;BALB/c小鼠10只,SPF级,雌性,5～6周龄,体重16～18 g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司[SCXK(京)2016-0002]。BALB/c卷毛鼠10只,SPF级,雌性,5～6周龄,16～18 g,来源于本实验室近交培育。动物饲养在解放军总医院第五医学中心动物实验中心[SYXK(军)2017-0016]。本实验严格按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀,通过了解放军总医院第五医学中心动物伦理委员会审查(IACUC-2017-006)。

1.1.2 细胞

H22肝癌细胞株来自本院中心实验室保存。

1.2 主要试剂与仪器

胰蛋白酶、DMEM培养基、胎牛血清等购自美国Hyclone公司;吸入性麻醉剂异氟烷购自上海玉研科技有限公司;全套解剖手术器械由本实验室提供,购自上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂;图像分析软件为Adobe Photoshop(CS6)和Image J软件(美国国立卫生研究院,1.51j8)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养实验

在KM小鼠体内腹腔注射复苏后的H22细胞株,待小鼠腹部隆起后,用无菌注射器抽取腹水,用生理盐水洗涤后经1000 r/min离心(5 min),弃上清液。用生理盐水将H22肝癌细胞数调整至每毫升1×107个备用。

1.3.2 构建进展期肝癌模型

将两组小鼠依次使用异氟烷进行麻醉。在小鼠胸骨下缘正中处开一个1.5 cm的竖形开口。将肝叶轻轻挤出并上翻放置于预置的湿润纱布上,即可清晰地看到与下腔静脉伴行的肝门静脉。使用1 mL灭菌注射器吸取备用细胞悬液,轻轻扎入肝门静脉,缓慢注射。注射体积为100 μL,细胞量约为1×106个。注射完毕,轻压止血后,快速将肝叶置入腹腔内,缝合消毒伤口。术后每日观察两组小鼠的恢复状态,待21 d后采集肝。

1.3.3 利用Image J软件对肝弥散病灶进行定量分析

选择获得的两组肝组织的最大肝叶,首先拍照获得垂直视角图片。进而对拍照所得的肝照片进行图像定量分析,具体分析步骤参考姜棋予等[6]的方法。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件分析数据,计量资料以平均数±标准差(±s)表示,采用独立样本t检验进行两组分析比较,P＜0.05与P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝多发弥散性肿瘤外观对比结果

结果显示:卷毛鼠组和正常小鼠组在相同的造模时间内均形成了多发性弥散性的肝肿瘤。肉眼观察发现卷毛鼠组的弥散性肿瘤占据肝的比例显著多于正常小鼠组,而且观察到肿瘤与周边的正常肝组织浸润关系更加密切(图1)。

图1 两组小鼠肝弥散性肿瘤外观对比结果Figure 1 Comparison of the appearance of liver diffuse tumor between the two groups

2.2 肝多发弥散性肿瘤病灶图像定量对比分析

结果显示:首先用Photoshop软件沿肝边缘截取得到肝整个背景图片(图2A),再用Image J软件获得了图片的RGB象限分析结果(图2B、2C、2D),选择对比度相对高的图2D进行分析。分别获得了卷毛鼠和正常小鼠肝整体比例图与肝肿瘤比例图(图3)。其中一只卷毛鼠的肝占图片总面积的37.54%,肿瘤组织占图片总面积的21.23%(图3A),而一只正常小鼠肝占图片总面积的35.19%,肿瘤组织占图片总面积的11.84%(图3B)。建立了基于图像分析软件Image J的肝照片定量分析方法。

图2 肝照片的选定及像限分析结果Note.A,All areas of liver organs were selected.B(Red),C(Blue),D(Green),Analysis results of three RGB image limits.Red arrow shows multiple and diffuse tumors in the liver.Figure 2 Selection of liver photos and results of image limit analysis

图3 肝总面积和肿瘤病灶识别预算定量分析Note.A,Liver ratios(top)and tumor ratios(bottom)in curly mice.B,Liver ratios(top)and tumor ratios(bottom)in normal mice.Figure 3 Quantitative analysis of total area of liver organs and budget of tumor focus identification

2.3 肝多发弥散性肿瘤比例对比分析

结果显示:两组小鼠的肝比例不具有显著性差异,而卷毛鼠的肿瘤比例和肿瘤占肝的比例均显著大于正常小鼠(P＜0.01)(见表1)。

表1 两组小鼠弥散性肿瘤比较(±s,n=10)Table 1 Comparison of diffuse tumor between the two groups

表1 两组小鼠弥散性肿瘤比较(±s,n=10)Table 1 Comparison of diffuse tumor between the two groups

注:与正常小鼠相比,*P＜0.01。Note.Compared with normal mice,*P＜0.01.

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3 讨论

依托实验动物建立肝细胞癌模型是肝细胞癌分子靶向治疗研究以及分子药理学研究的基础[7]。近年来可见利用门静脉注射方法构建进展期或转移性肝癌模型。刘毅等[8]建立肝癌细胞门静脉转移模型,研究发现部分机制可能是通过上调基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达实现。柴燕涛等[9]利用肝门静脉注射不同肝癌细胞系建立新型进展期肝肿瘤模型,为肝癌相关临床药物的筛选奠定了坚实基础。同时,研究者更倾向于利用各种成熟的图像成像技术来反映肿瘤的进展情况。余琦等[10]利用Image J软件对家兔动脉粥样硬化病变图像进行定量分析,能够准确和有效的评估动脉粥样硬化病变程度。张鑫等[11]利用Image J软件建立白癜风白斑面积的数字化测量方法,为临床客观评价皮损的严重程度及其动态变化提供可靠且简便易行的图形面积数字化操作流程。而利用门静脉注射肿瘤细胞构建自发突变小鼠进展期肝细胞癌模型,并利用Image J软件对肿瘤进行观察的报道尚未见到。

因此,本研究在前期发现突变卷毛鼠与正常小鼠构建皮下移植和原位肝移植模型之间存在显著差异的基础上,应用门静脉注射肿瘤细胞构建进展期肝细胞癌模型,进而对两组小鼠的差异性进行比较。结果显示:两组小鼠的肝均形成明显的弥散性肿瘤。但卷毛鼠组弥散性肿瘤占据肝的比例显著多于正常小鼠组,而且肿瘤与周边的正常肝组织浸润关系更加密切,与前期其他方式移植肿瘤的研究结果相一致[12]。现研究中肿瘤转移动物模型多采用经尾静脉注射,肿瘤细胞经下腔静脉回心后经由肺动脉抵达肺部[13],难以到达肝,很难直观反映与模拟进展期肝肿瘤的特性[14-15]。而本实验选择经肝门静脉直接注射肿瘤细胞,肿瘤细胞不仅可随肝内部丰富的血流迅速到达肝各个部位,还可长时间留驻肝内部,尤其在接近肝包膜处毛细血管丰富,能够很好形成多发弥散性的肿瘤病灶。同时皮下肿瘤和原位肿瘤模型多为单个,可通过测量计算其肿瘤体积进行量化分析,获得照片等图像信息也较为容易。但对于多发性和弥散性肿瘤的量化分析则有难度。曾有研究者以高内涵等为代表的图像采集与分析系统,但整个工作站价格昂贵,而且对于图形文件格式的要求较为严格,因此普及性较差[16-17]。本实验采用Image J软件可直观的对弥散性肿瘤图片进行定量分析,得出卷毛鼠与正常小鼠肝比例分别为(37.82±1.31)%和(36.21±1.85)%、肿 瘤 比 例 分 别 为(20.43±4.03)%和(9.20±2.01)%、肿瘤占肝比分别为(53.79±9.11)%和(25.35±5.16)%,卷毛鼠与正常小鼠的肝比例不具有显著性差异,而卷毛鼠的肿瘤比例和肿瘤占肝的比例均显著大于正常小鼠(P＜0.01),不仅建立了Image J软件对弥散性肿瘤进行图像定量分析的方法,而且进一步验证了卷毛鼠的肝癌成模能力强于正常小鼠。

综上所述,BALB/c突变卷毛鼠经门静脉注射肿瘤细胞形成多发弥散性肿瘤的能力优于正常BALB/c小鼠,同时利用Image J软件对弥散性肿瘤进行定量分析,进一步验证了BALB/c突变卷毛鼠在肝肿瘤成模方面的优势所在,以期该突变卷毛鼠能够成为开展肝癌动物模型各项研究的成熟实验平台。