miR-27a调控PI3K/AKT/mTOR通路介导的自噬对肺炎链球菌诱导人肺泡上皮细胞损伤的影响

王艳琼董利利李 敏张 磊徐沙沙汤 昱

(郑州大学附属儿童医院 河南省儿童医院 郑州儿童医院呼吸科,郑州 450018)

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)是一种革兰氏阳性的胞外细菌,通常是定植在人们口腔和鼻咽部的正常菌群,当机体免疫功能受损时可引起急性感染,是造成社区获得性肺炎的常见原因,重者可危及生命[1],其在人肺泡上皮细胞(human alveolar epithelial cells,HPAEpiC)中可通过活性氧的过度生成和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的抑制,显著增加微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达来激活自噬[2]。而自噬可通过调节炎症介质的释放,进一步调控肺泡上皮细胞的损伤[3]。另外,miRNAs是在真核生物中发现的一类内源性的具有基因调控功能的非编码RNA,其大小长约20～25个核苷酸,其中,miR-27a在细胞生长和发育过程中起关键作用[4]。前人研究发现,miR-27a可通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/mTOR信号通路调节骨关节炎中关节软骨细胞的自噬和凋亡[5],而沉默miR-27a可通过激活脾酪氨酸激酶依赖的mTOR信号通路,调控黑色素瘤细胞自噬和凋亡[6]。但是,目前miR-27a调控PI3K/AKT/mTOR通路对SP诱导HPAEpiC自噬和损伤的影响尚未见报道。因此,本研究使用SP诱导HPAEpiC同时下调miR-27a或过表达/干扰PI3K,观察其对细胞增殖、凋亡、自噬及PI3K/AKT/mTOR通路的影响,初步探讨其分子机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株和菌株

HPAEpiC(货号:XY-XB-1271)购自上海烜雅生物科技有限公司;肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP;货号:ATCC 49619),购自上海欣硕生物科技有限公司。

1.2 主要试剂与仪器

含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基,Giboc公司;白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-10(IL-10)ELISA试剂盒,上海酶联生物科技有限公司;RNA提取试剂盒,天根生化科技有限公司;逆转录试剂盒,Genecopoeia公司;双荧光素酶检测试剂盒和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒,索莱宝生物科技有限公司;qRT-PCR检测试剂盒,上海生工生物科技有限公司;CCK-8试剂盒,济南远达晶美生物科技有限公司;野生型和突变型PI3K 3’UTR荧光素酶报告基因载体(PI3K-WT、PI3KMUT)、pcDNA-NC(过表达阴性对照)、pcDNA-PI3K(PI3K过表达载体)、Si-NC(RNA干扰阴性对照)和Si-PI3K(RNA干扰PI3K载体)、miR-27a NC(miR-27a阴性对照)、miR-27a模拟物(miR-27a mimics)、miR-27a抑制物(miR-27a inhibitor)以及miR-27a、U6引物,上海生工生物工程有限公司;Lipofectamine 3000转染试剂盒,Invitrogen公司;PVDF膜、β-actin鼠抗,Sigma公司;ECL显色试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒,北京中山金桥生物科技有限公司;PI3K、Beclin1、LC3-I、LC3-II、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、β-actin鼠抗和辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗,Abcam公司;尼康SMZ745光学显微镜,上海普赫生物科技有限公司;FACSCanto流式细胞仪,Beckman公司;TL988 qRT-PCR仪,西安天隆科技有限公司;ChemiDoc-MP全能型凝胶成像分析系统,山东三瑞科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养与分组

HPAEpiC使用含10% FBS的RPMI1640培养基(含100 U/L青霉素和100 mg/L链霉素),置于37℃,5% CO2培养箱中培养,待细胞生长密度达90%左右时,在培养基中加入菌液浓度为1×108CFU/mL的SP诱导损伤[7]。在加入SP诱导前48 h使用Lipofectamine 3000转染试剂盒分别转染细胞miR-27a-NC(miR-27a-NC组)、miR-27a-inhibitor(miR-27a-inhibitor组)、pcDNA-NC(pcDNA-NC组)、pcDNA-PI3K(pcDNA-PI3K组),共转染细胞miR-27a-NC和Si-NC(miR-27a-NC+Si-NC组)、miR-27ainhibitor和Si-NC(miR-27a-inhibitor+Si-NC组)、miR-27a-NC和Si-PI3K(miR-27a-NC+Si-PI3K组)、miR-27a-inhibitor和Si-PI3K(miR-27a-inhibitor+Si-PI3K组)。另取非诱导细胞为对照组,诱导且未转染细胞为诱导组。

1.3.2 qRT-PCR检测正常HPAEpiC和SP诱导的HPAEpiC中miR-27a表达水平

RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA,逆转录试剂盒得到cDNA,以cDNA为模板,按照qRT-PCR试剂盒说明书配置PCR反应体系、设定反应条件。以U6作为内参,根据2-ΔΔCt算法计算miR-27a表达水平,miR-27a正、反向引物为5’-TCCGTGAGAGC TGGAAAACC-3’、5’-TGGTTCTAACTAACTCCAGCC G-3’、U6正、反向引物为5’-GACGGCTTCCCAATAA CAG-3’、5’-ATTGAGGCTTCAGCACCAC-3’。

1.3.3 生物信息学预测和双荧光素酶验证miR-27a和PI3K的靶向关系

采用TargetScan在线网站(http://www.targetscan.org/)对miR-27a和PI3K的结合位点进行分析。取对数生长期的HPAEpiC接种于96孔板,常规培养24 h后,将细胞分为miR-27a-mimics+PI3K-WT组、miR-27a-NC+PI3K-WT组、miR-27amimics+PI3K-MUT组和miR-27a-NC+PI3K-MUT组,每组设6个复孔,使用Lipofectamine 3000转染试剂盒进行细胞共转染。转染48 h后,按照双荧光素酶检测试剂盒说明书检测荧光素酶活性,验证miR-27a与PI3K的靶向关系。

1.3.4 CCK-8法检测各组细胞增殖活性

收集各组细胞,每孔100 μL接种至96孔板中,加入浓度为10%的CCK-8溶液,继续培养2 h后,于酶标仪上测定各孔在450 nm波长下的OD值,细胞增殖率(%)=(实验组OD450nm-空白组OD450nm)/(对照组OD450nm-空白组OD450nm)。

1.3.5 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率

收集各组细胞,1200 r/min离心5 min,弃培养基,参照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书上流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.3.6 ELISA检测各组细胞上清液中IL-6和IL-10含量

每组各取约2 mL细胞悬液,1200 r/min离心10 min,取上清,严格按照IL-6和IL-10 ELISA试剂盒说明书进行检测,每组设置6个重复。

1.3.7 Western blot法检测各组细胞中PI3K/AKT/mTOR通路及自噬相关蛋白表达水平

收集各组细胞,使用蛋白提取试剂盒提取总蛋白。BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量,依次进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、转PVDF膜、5%脱脂奶粉封闭、1∶2000浓度稀释后的PI3K、Beclin1、LC3-I、LC3-II、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、β-actin鼠抗4℃过夜孵育、含辣根过氧化物酶缀合的二抗(1∶5000)中室温孵育2 h,用ECL显色试剂盒显色,以β-actin内参,全能型凝胶成像分析系统分析蛋白表达水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析,计量资料以平均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用SNK-q检验;P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 正常和SP诱导的HPAEpiC中miR-27a及PI3K蛋白表达水平

与对照组miR-27a(1.00±0.00)、PI3K蛋白(0.84±0.09)相比,诱导组细胞中miR-27a表达水平(1.73±0.18)升高(P＜0.05),PI3K蛋白表达水平(0.29±0.03)降低(P＜0.05)。见图1。

图1 对照组和诱导组PI3K蛋白表达图Figure 1 PI3K protein expression in control group and induction group

2.2 下调miR-27a或过表达PI3K对SP诱导HPAEpiC增殖、凋亡及炎性因子影响

与对照组相比,诱导组miR-27a表达水平、细胞凋亡率、IL-6含量升高(P＜0.05),PI3K蛋白水平、细胞增殖率和IL-10含量降低(P＜0.05);与miR-27a-NC组相比,miR-27a-inhibitor组miR-27a表达水平、细胞凋亡率、IL-6含量降低(P＜0.05),细胞增殖率和IL-10含量升高(P＜0.05);与pcDNA-NC组相比,pcDNA-PI3K组细胞凋亡率、IL-6含量降低(P＜0.05),PI3K蛋白水平、细胞增殖率和IL-10含量升高(P＜0.05)。见图2、表1。

表1 各组细胞增殖、凋亡及炎性因子含量比较(n=6)Table 1 Proliferation,apoptosis and inflammatory factor content of each group

图2 各组细胞凋亡检测图Figure 2 Apoptosis detection of each group

2.3 下调miR-27a或过表达PI3K对SP诱导HPAEpiC中Beclin1、LC3-I、LC3-II、AKT、mTOR蛋白表达影响

与对照组相比,诱导组、miR-27a-NC组和pcDNA-NC组细胞Beclin1蛋白表达水平和LC3-II/I比值升高(P＜0.05),AKT、mTOR蛋白磷酸化水平降低(P＜0.05);miR-27a-inhibitor组细胞Beclin1蛋白表达水平和LC3-II/I比值降低(P＜0.05),AKT、mTOR蛋白磷酸化水平升高(P＜0.05);与pcDNANC组相比,pcDNA-PI3K组细胞Beclin1蛋白表达水平和LC3-II/I比值降低(P＜0.05),AKT、mTOR蛋白磷酸化水平升高(P＜0.05)。见图3。

图3 各组细胞自噬相关蛋白及AKT、mTOR蛋白磷酸化水平比较Note.Compared with the control group,aP＜0.05.Compared with the miR-27a-NC group,bP＜0.05.Compared with the pcDNA-NC group,cP＜0.05.Figure 3 Autophagy related proteins and phosphorylation levels of AKT and mTOR proteins of each group

2.4 miR-27a和PI3K基因靶向关系的预测与验证

生物信息学预测结果显示,miR-27a序列上存在与PI3K3’UTR结合的连续位点。与miR-27a-NC+PI3K-WT组(1.00±0.00)相比,miR-27a-mimics+PI3K-WT组(0.37±0.04)荧光素酶活性显著降低(P＜0.05),而miR-27a-NC+PI3K-MUT组(0.95±0.10)和miR-27a-mimics+PI3K-MUT组(1.03±0.11)荧光素酶活性无明显变化。见图4。

图4 生物信息学预测miR-27a和PI3K3’UTR结合位点Note.WT,Wild-type.MUT,Mutant-type.UTR,Untranslated region.Figure 4 Bioinformatics prediction of miR-27a and PI3K3’UTR binding sites

2.5 下调miR-27a和干扰PI3K对SP诱导HPAEpiC增殖、凋亡及炎性因子含量的影响

与miR-27a-NC+Si-NC组相比,miR-27a-inhibitor+Si-NC组细胞增殖率和IL-10含量升高(P＜0.05),细胞凋亡率和IL-6含量降低(P＜0.05);miR-27a-NC+Si-PI3K组细胞增殖率和IL-10含量降低(P＜0.05),细胞凋亡率和IL-6含量升高(P＜0.05)。miR-27a-inhibitor+Si-PI3K组细胞增殖率和IL-10含量较miR-27a-inhibitor+Si-NC组降低(P＜0.05),较miR-27a-inhibitor+Si-PI3K组升高(P＜0.05),细胞凋亡率和IL-6含量较miR-27a-inhibitor+Si-NC组升高(P＜0.05),较miR-27a-inhibitor+Si-PI3K组降低(P＜0.05)。见图5、图6。

图5 各组细胞增殖、凋亡及炎性因子含量比较Note.Compared with the miR-27a-NC+Si-NC group,aP＜0.05.Compared with the miR-27a-inhibitor+Si-NC group,bP＜0.05.Compared with the miR-27a-NC+Si-PI3K group,cP＜0.05.Figure 5 Proliferation,apoptosis and inflammatory factor content of each group

图6 各组细胞凋亡检测图Figure 6 Apoptosis detection of each group

2.6 下调miR-27a和干扰PI3K对SP诱导HPAEpiC的蛋白表达影响

与miR-27a-NC+Si-NC组 相 比,miR-27ainhibitor+Si-NC组细胞Beclin1蛋白表达水平和LC3-II/I比值降低(P＜0.05),AKT和mTOR蛋白磷酸化水平升高(P＜0.05);miR-27a-NC+Si-PI3K组细胞Beclin1蛋白表达水平和LC3-II/I比值升高(P＜0.05),AKT和mTOR蛋白磷酸化水平降低(P＜0.05)。miR-27a-inhibitor+Si-PI3K组细胞Beclin1蛋白表达水平和LC3-II/I比值较miR-27a-inhibitor+Si-NC组升高(P＜0.05),较miR-27a-NC+Si-PI3K组降低(P＜0.05),AKT和mTOR蛋白磷酸化水平较miR-27a-inhibitor+Si-NC组降低(P＜0.05),较miR-27a-NC+Si-PI3K组升高(P＜0.05)。见图7。

图7 各组细胞自噬相关蛋白及AKT、mTOR蛋白磷酸化水平Note.Compared with the miR-27a-NC+Si-NC group,aP＜0.05.Compared with the miR-27a-inhibitor+Si-NC group,bP＜0.05.Compared with the miR-27a-NC+Si-PI3K group,cP＜0.05.Figure 7 Autophagy related proteins and phosphorylation levels of AKT and mTOR proteins of each group

3 讨论

细菌性肺炎每年可造成多达200万人死亡,最常见的肺炎病原体是肺炎球菌和SP,约占社区获得性肺炎的半数,医院获得性肺炎的3%～10%[8],对人类健康造成严重威胁。刘煌等[9]研究发现SP感染肺泡上皮细胞后,IL-10含量显著降低,IL-6含量显著升高,引起炎症反应且使肺泡上皮细胞凋亡。本研究参照王勇等[7]方法,用1×108CFU/mL SP诱导HPAEpiC,发现细胞凋亡率、IL-6含量显著升高,细胞增殖率、IL-10含量显著降低,与刘煌等[9]一致,表明模型制备成功。本研究还发现,诱导细胞中miR-27a表达水平、Beclin1蛋白表达水平和LC3-II/I比值显著升高,PI3K蛋白表达及AKT、mTOR蛋白磷酸化水平显著降低,提示SP诱导HPAEpiC损伤与miR-27a和PI3K/AKT/mTOR通路密切相关。

miR-27a对调节多态性、肿瘤发生、细胞增殖、凋亡及血管生成中发挥重要作用。miR-27a水平增加可导致细胞周期阻滞,抑制人少突胶质细胞增殖[10]。而敲低miR-27a-3p可通过增加人脐带静脉内皮细胞的狭缝引导配体2表达来抑制脂多糖诱导的损伤[11]。miR-27a上调还可引起糖尿病肾病中足细胞损伤[12]。本研究发现,抑制miR-27a可提高SP诱导的HPAEpiC增殖率、IL-10含量、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平,降低miR-27a表达水平、细胞凋亡率、IL-6含量、Beclin1蛋白表达水平和LC3-II/I比值,其中Beclin1和LC3-II/I为自噬标志物,可用于反映自噬强度[13],提示抑制miR-27a,可能通过抑制细胞凋亡及自噬,缓解SP诱导的HPAEpiC损伤。但miR-27a是否通过调控PI3K发挥作用,尚需进一步研究。

PI3K参与多种细胞功能,可与AKT结合,磷酸化AKT的Ser308致使AKT活化,AKT通过下游多种途径对靶蛋白进行磷酸化而发挥抗凋亡作用。PI3K/AKT/mTOR信号通路与自噬密切相关[14]。本研究发现,过表达PI3K可提高SP诱导的HPAEpiC增殖率、IL-10含量、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平,降低细胞凋亡率、IL-6含量、Beclin1蛋白表达水平和LC3-II/I比值,提示过表达PI3K,可能通过抑制细胞凋亡及自噬,缓解SP诱导的HPAEpiC损伤。Zeng等[15]研究发现4苯基丁酸能够上调急性肺损伤模型中AKT/mTOR通路,抑制自噬,缓解LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤,与本研究结果一致。然而,Du等[16]研究发现蛋白酶激活受体-2能够通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,抑制自噬,从而引发肾小管上皮细胞炎症,另有研究发现抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,可通过促进自噬,减轻动脉粥样硬化病变斑块的形成[17]。这与本研究并不一致,这可能是由于自噬过程较快,而且细胞既可通过提高自噬减少细胞坏死,减轻有毒物质的积累,又可通过主动降低自身自噬活性,减少因自噬引起的细胞死亡,并且来自于外界的多种刺激条件及环境因素各不相同[18],所以不同细胞和组织间的自噬活性存在一定的差异性。早期Liu等[19]研究发现miR-27a通过靶向PI3K调控髓核细胞凋亡。本研究通过生物信息学预测及双荧光素酶实验验证发现,miR-27a和PI3K存在靶向关系,将miR-27a-inhibitor和Si-PI3K共转染SP诱导HPAEpiC,发现miR-27a-inhibitor+Si-PI3K组细胞增殖率、IL-10含量、Beclin1蛋白表达水平和LC3-II/I比值较miR-27a-inhibitor+Si-NC组降低,而细胞凋亡率、IL-6含量、AKT和mTOR蛋白磷酸化水平升高,提示抑制miR-27a表达对SP诱导HPAEpiC损伤的缓解作用,可被干扰PI3K逆转。

综上所述,在SP诱导HPAEpiC损伤过程中,miR-27a表达上调,而抑制miR-27a可靶向上调PI3K蛋白表达,激活其下游AKT/mTOR信号通路,进而抑制细胞自噬,缓解SP所致HPAEpiC损伤。但是,关于miR-27a的靶基因较多,是否还涉及其它信号通路,尚需深入研究。