FIRS早产儿脐血MMP-9、TIMP-1水平变化及其与肺损伤关系的研究

闫祎炜江 莲李 梅张会芬沈 颖张文浩张文婷

(河北医科大学第四医院儿科,石家庄 050000)

随着早产儿诊治水平不断提高,早产儿的数量及存活率逐年提升,新生儿中早产儿发生率为7.8%,其中出生体重小于1500 g占32.3%,而呼吸系统并发症的发生率为52.3%[1]。支气管肺发育不良(bronchopulmonory dysplasia,BPD)是早产、高氧损伤、机械通气、感染等多种因素综合作用引起的一种氧依赖疾病,是影响早产儿预后的重要因素,目前其发病机制尚未完全明确。研究表明,胎儿炎症反应综合征(fetal inflammatory response syndrome,FIRS)与BPD明显相关,是不良新生儿结局的重要因素[2]。但是,FIRS能否确切导致BPD的发生机制尚不明确。尚有研究表明,FIRS介导的炎性细胞因子会明显上调基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)的表达水平[3]。而高氧[4]、机械通气[5]等因素导致的BPD模型中亦存在MMP-9水平升高。本研究通过临床研究及动物实验以探讨FIRS介导MMP-9诱发BPD的具体机制,为临床治疗提供新的靶点并发掘早期预测指标。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 研究人群

纳入2018年5月～2019年12月于河北医科大学第四医院出生的早产儿共118例,其中男性66例,女性52例,胎龄分布27+6周～36+5周,出生体重分布900～3600 g(表1)。依据胎龄及FIRS诊断标准进行分组,FIRS主要诊断指标[6]:早产儿脐血IL-6＞11 pg/L,羊水CRP＞6 mg/L,胎盘和(或)脐带病理存在炎性浸润,羊水涂片可见炎性细胞聚集;辅助诊断指标:产妇发热、心率＞100次/分,胎心＞160次/分,子宫压痛,羊水嗅臭,外周血白细胞计数每升＞15×109个。对照组1(胎龄≤32周,非FIRS),n=25;对照组2(32周＜胎龄＜37周,非FIRS),n=32;研究组1(胎龄≤32周,FIRS),n=33;研究组2(32周＜胎龄＜37周,FIRS),n=28。排除母亲分娩前存在妊娠合并非感染疾病、分娩过程中出现窒息缺氧以及合并者其他系统严重疾病患儿。

1.1.2 观察指标

留取断脐后早产儿端脐静脉血(2 mL)及胎盘组织。检测脐血中的白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP-1)、MMP-9水平。制备胎盘组织切片观察胎盘病理改变。患儿随访至28 d,明确是否发生BPD结局。

1.1.3 实验动物

本实验使用45只清洁级10周龄昆明小鼠购自河北医科大学实验动物中心[SCXK(冀)2018-004],其中雄鼠15只,体重35～40 g,雌鼠30只,体重30～35 g。小鼠饲养于河北医科大学第四医院动物实验中心[SYXK(冀)2018-001],实验方案经河北医科大学第四医院实验动物伦理委员会审核通过(1ACUC-4thHos Hebmu-2019006),并按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

人IL-6、MMP-9、TIMP-1、ELISA试剂盒购自艾莱萨生物科技有限公司(中国);维甲酸购自山东良福制药;脂多糖购自Sigma公司;C-反应蛋白测定试剂盒购自上海捷门生物技术公司(中国);瑞姬氏染色液购自温州康泰生物科技公司(中国);YXI-2离心机购自三洋公司(日本);全自动酶标检测仪(VERS Amax,美国);全自动洗板机购自Sigma公司(Aw1,美国);-80℃超低温冰箱购自SANYO公司(日本);电热恒温水浴箱购自上海森信实验有限公司(JY-17-1,中国);高精度加样器及枪头购自BBI公司(加拿大);显微镜购自OLYPUS公司(CX-21,日本);特定蛋白分析仪购自OLYPUS公司(Au2700,日本)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型制备与分组

饲养1周后将雌雄小鼠按2∶1合笼,次日清晨观察到阴栓的雌鼠视为怀孕第1天。参照Rounioja等[7]制备FIRS小鼠模型(图1),将孕鼠随机分为3组,每组各10只,FIRS(lipopolysaccharide,LPS干预)组、维甲酸(retinoic acid,RA干预)组、生理盐水(normal saline,NS干预)组,孕15 d时LPS及RA组羊膜囊内注射LPS,总量不超过100 μg/kg,NS组予等量NS羊膜囊注射,密切观察孕鼠生命活动,注意有无感染、阴道流血流液及流产征象,RA组小鼠在孕17 d开始RA灌胃,剂量50 μg/kg,至分娩,将剖宫产及顺产娩出的胎盘进行病理检查,胎盘组织存在炎性浸润则认为制模成功。本研究流产率10.00%,建模成功率为83.73%。

图1 FIRS小鼠建模流程Note.A,Observation of the formation of vaginal suppository.B,In the 15th trimester of pregnancy,the amniotic sac was exposed by laparotomy,then the abdominal cavity was sutured after lipopolysaccharide injection.C,Pregnant mice were normal after drug injection.D,Pregnant mice were normal in birth.E,A large number of inflammatory cells were infiltrated in the placental tissue(HE)after delivery,and the villous structure disappeared,and edema and partial fibrosis were observed,and the modeling was successful.F,Normal placental tissue(HE).Figure 1 FIRS mice modeling process

1.3.2 标本收集

随机取3组3只孕19 d孕鼠,行剖宫产手术,留取胎鼠的胎盘、肺组织,余孕鼠待自然分娩,分别于产后1、3、7、14 d处死仔鼠(每个时间点每组n=10),均留取肺组织。

1.3.3 观察指标测定

采用Real-time PCR法测定肺组织MMP-9、TIMP-1表达水平,HE染色观察胎盘、肺组织病理改变。

1.4 统计学方法

所有数据通过SPSS(21.0,IBM Support Forum)及GraphPad Prism(v8.2.1.441,San Diego,CA 92108)软件进行分析,以平均数±标准差(±s)表示,计量资料采用t检验比较,多组均数的比较采用重复测量方差分析,相关性分析采用Spearman’s线性相关。计数资料两组资料比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 一般资料

两组患者在胎龄、性别、出生体重和Apgar评分均无显著差异(P＞0.05)(表1)。

表1 一般资料Table 1 General characteristic

2.2 早产儿脐血中IL-6、MMP-9和TIMP-1表达水平

与对照组相比,同胎龄FIRS组IL-6、MMP-9、TIMP-1水平及M/T比值显著增加(P＜0.01)。在FIRS1组和FIRS2组之间,IL-6、MMP-9和TIMP-1的水平以及M/T比值无显著差异(P＞0.05)。对照组2中IL-6水平与对照组1中比较无显著差异(P＞0.05)。对照组2中MMP-9和TIMP-1的水平显著升高,而M/T比值显著降低(P＜0.01)(表2)。

表2 不同组别脐血IL-6、MMP-9、TIMP-1、M/T比值水平比较Table 2 Levels of IL-6,MMP-9,TIMP-1 and M/T ratio in different groups

2.3 IL-6与MMP-9、TIMP-1和M/T比值之间的相关性

IL-6与MMP-9和TIMP-1及M/T的比例呈正相关(PMMP-9＜0.01,rMMP-9=0.58;PTIMP-1＜0.01,rTIMP-1=0.45;PM/T＜0.01,rM/T=0.44)(图2)。

图2 早产儿IL-6和MMP-9、TIMP-1及M/T比值之间的相关性Figure 2 Correlation between IL-6 and M/TMP-9,TIMP-1 and M/T ratio in preterm infants

2.4 早产儿胎盘组织的组织学检查

对照组(图3A)胎盘组织无明显病理改变,绒毛膜羊膜炎病变多集中在绒毛膜部位,可见炎细胞浸润(图3B)。此外,急性炎症组织呈现炎性细胞浸,伴组织充血及水肿(图3C)。

图3 胎盘组织(HE染色)Note.A,Normal placental tissue showed no obvious pathological changes.B,Chorionic tissue showed mild inflammatory cell infiltration.C,Acute inflammatory placental tissue showed congestion and edema,aggregation of neutrophils.Figure 3 Placental tissue(HE staining)

2.5 疾病结局

FIRS组BPD发生率高于同胎龄对照组(P＜0.05)(表3)。

表3 不同组中BPD发生率的比较Table 3 Incidence of BPD in different groups

2.6 仔鼠肺组织病理改变

程度明显减轻(图4)。

2.7 不同日龄FIRS鼠肺组织IL-6、MMP-9、TIMP-1表达水平

NS组为正常肺组织(图4A1～D1)RA组(图4A3～D3);FIRS组肺泡数目减少(图4A2～D2),肺泡间隔减少、增厚,间质部分及肺泡内可见少量出血,部分肺泡结构破坏;RA组与FIRS组病变相似,

图4 肺组织(HE染色)Note.A1～D1,Lung tissue of mice in the control group at 19 days of gestation,1,7 and 14 days after delivery.A2～D2,Lungs of mice in the control group at 19 days of gestation,1,7 and 14 days in the FIRS group tissue.A3～D3,Lung tissue of mice in the control group of RA group at 19 days gestation,1,7 and 14 days postpartum.Figure 4 Lung tissue(HE staining)

FIRS组:19日龄胎鼠及1、7、14日龄新生鼠IL-6、MMP-9、TIMP-1表达水平及M/T比值均明显高于同日龄对照组(P＜0.01)。RA干预后:19日龄胎鼠及1、7、14日龄新生鼠IL-6、MMP-9、TIMP-1表达水平及M/T比值仍明显高于同日龄对照组(P＜0.01),但该日龄胎鼠及新生鼠IL-6、MMP-9、TIMP-1表达水平及M/T比值则明显低于同日龄FIRS组(P＜0.01)(表4)。

表4 不同日龄各组胎鼠/新生鼠肺组织IL-6、MMP-9、TIMP-1、M/T比值表达水平的比较(n=8)Table 4 Expression of IL-6,MMP-9,TIMP-1,M/T ratio of lung tissue of different groups in different time points

2.8 FIRS鼠肺组织IL-6与MMP-9、TIMP-1及M/T的相关性分析

小鼠肺组织中IL-6与MMP-9(PMMP-9＜0.01,rMMP-9=0.741)、TIMP-1(PTIMP-1＜0.01,rTIMP-1=0.677)及M/T呈正相关(PM/T=0.02,rM/T=0.410)(图5)。

图5 小鼠IL-6和MMP-9,TIMP-1以及M/T比值之间的相关性Figure 5 Correlation between mice IL-6 and MMP-9,TIMP-1 and M/T ratio

3 讨论

早产是致使胎儿脏器发育不完全最重要的病因,据报道,早产与FIRS密切相关[8]。Helmo等[9]研究表明IL-6(＞11 pg/mL)是导致重大新生儿发病的独立危险因素。Rangel-Frausto等[10]通过检测胎儿脐血细胞因子变化,结果显示胎儿早产前IL-6水平明显升高。而通过IL-6、IL-1β和TNF-α介导的炎症反应会刺激MMP的分泌[11-12],其中MMP-9是白细胞分泌的4型胶原酶,与胎膜损伤有关[13]。在本研究中,出现FIRS的新生儿脐带血中IL-6、MMP-9、TIMP-1水平及M/T的比值明显增加,且IL-6水平与MMP-9和TIMP-1水平以及M/T比值呈正相关。而上述炎性指标对FIRS具有一定的诊断价值,是预测BPD发生率的有效指标。

此外,笔者对胎龄的因素影响进一步探讨。既往研究报道,MMP-9水平似乎与胎龄有关,未发生BPD的早产儿中,在妊娠33～36周时观察到最高水平,而足月新生儿中TIMP-1水平最高[14]。Bednarek等[15]报道,早产儿的MMP-9水平和胎龄也明显相关。本研究结果发现,对照组2中MMP-9和TIMP-1的水平高于对照组1。但是,对照组2的M/T比值低于对照组1。同样,FIRS组2中的M/T比值略低于FIRS组1。提示M/T比值与胎龄呈负相关,这可能和胎龄增加肺部发育逐渐成熟相关。

尚有研究表明,BPD早产儿体内的MMP-9和TIMP-1的水平明显上调[14-15]。在本研究中,FIRS组1的BPD损伤的发生率均高于对照组1。但是,FIRS组2和对照组2的BPD发生率无显著差异,这些结果表明BPD可能与胎龄也存在密切相关。Mittendorf等[16]报道的结果表明胎龄和低出生体重可能是BPD的主要风险,和本研究结果一致。此外,本研究还发现FIRS组1的BPD发生率高于FIRS组2。表明MMP-9和TIMP-1的水平与胎龄结合可能是预测BPD发生的更为精确的指标。Fukunaga等[17]进行的一项临床研究结果显示,在胎龄30周的婴儿中,脐带血中M/T的比例与BPD的发生明显相关,该研究结果和本研究一致。

此外笔者在小鼠动物模型中验证了FIRS介导MMP-9上调诱发BPD的相关性并探讨了药物治疗的可行性。建模成功后,小鼠胎盘病理显示FIRS模型的胎盘组织可见大量炎细胞浸润,绒毛结构消失,组织水肿及部分纤维化。本研究结果显示FIRS组小鼠可见IL-6、MMP-9、TIMP-1及M/T明显高于对照组,而MMP-9抑制剂组可见炎症指标明显降低,且上述炎症指标变化趋势呈明显正相关。上述结果和临床研究结果相一致。Chang等[18]进行的一项动物实验结果显示:M/T比值在BPD的进程中起着重要作用,并且观察到4-苯甲酸、卟啉氯化物、维甲酸可以有效降低大鼠模型中M/T比值,并减少BPD的发生,其结果和本研究相似。

综上,FIRS可通过释放IL-6,调节MMP-9、TIMP-1水平及M/T比值,介导BPD发生,应用MMP-9抑制剂可在肺损伤过程中发挥保护作用,为临床治疗提供了潜在的药物治疗靶点。