稳定表达E-cadherin的TW2R细胞增强人胚胎干细胞生长

宋 琼滕夏虹王丽惠许倩倩孙晓婷邹春林*

(1.广西医科大学转化医学研究中心,广西医科大学基础医学院,南宁 530021;2.长寿与老年相关疾病教育部重点实验室,南宁 530021;3.广西医科大学国际教育学院,南宁 530021)

人多能干细胞,包括人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)和人诱导多能干细胞(human induced Pluripotent Stem Cells,hiPSCs),具有体外无限增殖、保持未分化状态的自我更新能力和多向分化潜能,在转化医学、再生医学以及新药筛选方面有着广阔的运用应用前景[1-5]。目前干细胞hESCs和hiPSCs的体外培养,一般需要小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)作为饲养层细胞,但其应用于临床有可能导致动物源性病原体污染及免疫排斥等问题[6-8]。为了解决上述问题,各种无动物源性饲养层培养体系被研发,包括无饲养层培养体系和人源饲养层细胞培养体系[9-12]。虽然已有研究报道,某些体细胞可在无饲养层培养条件下重编程为iPSCs,但重编程的效率明显比在MEF上的重编程效率低,并仍然需要动物源性的基质来支持细胞的生长,因此不利于临床的转化应用[13-15]。已有研究报道在端粒酶的3个亚单位中,人端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是调节端粒酶活性的关键组分,正常人体细胞中hTERT不表达或表达量很低,如果在体外培养的体细胞中过表达hTERT,可明显延长培养细胞的寿命,从而建立永生化的细胞系[16-18]。此外,也有研究报道,Wnt/β-catenin信号通路在维持胚胎干细胞的多能性和体细胞重编程过程中发挥着重要作用[19]。Wnt3a作为Wnt家族的重要成员,有研究表明Wnt3a在调控干细胞多能性和自我更新中发挥重要的作用[20-21]。有研究报道,在人胚胎干细胞培养基中加入Wnt3a促进细胞增殖,并且不影响细胞凋亡[22]。在水牛胚胎干细胞培养基中加入Wnt3a,通过激活Wnt/β-catenin信号通路,β-catenin表达显著上调,进而激活下游靶基因Nanog的表达,从而维持胚胎干细胞多能性[23]。过表达Wnt3a的小鼠成纤维细胞制备的条件培养基可以促进小鼠胚胎干细胞的增殖能力,维持小鼠胚胎干细胞自我更新能力和多能分化能力[24]。因此,在前期研究中,通过在人骨髓间充质细胞中稳定表达hTERT基因和Wnt3a基因,获得了永生化人源饲养层细系TW2R,TW2R细胞系虽然能够支持人胚胎干细胞的不分化生长,但在支持人胚胎干细胞生长效率方面,与MEF比较并无明显优势[25]。有研究结果显示跨膜蛋白E-cadherin所介导的细胞间相互作用在体细胞重编程中起着非常重要的作用[26],因此本研究提出将E-cadherin基因转导至永生化人源饲养层细胞内,将有可能获得可高效支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞系,并有助于人多能干细胞的相关研究和临床应用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级8周龄NOD-SCID雄性小鼠,2只,25～26 g,购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK(沪)2017-0005],并饲养于广西医科大学实验动物中心[SYXK(桂)2020-0004],实验中所涉及的所有动物实验操作均获得广西医科大学实验动物伦理委员会的批准(201711032),遵循3R原则。

1.1.2 细胞与病毒

人胚胎干细胞系H9由首都医科大学宣武医院细胞治疗中心惠赠,永生化人间充质干细胞(human Mesenchymal Stem Cells,hMSCs)细胞系TW2R是由先前实验通过在hMSCs中过表达hTERT基因和Wnt3a基因建立的永生化人饲养层细胞系[25],表达E-cadherin基因和嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因的慢病毒由上海吉玛制药技术有限公司制备。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM(low glucose)培养基、KNOCKOUT DMEM培养基、KNOCKOUT Serum Replacement、MEM Non-Essential Amino Acids Solution、胎 牛 血 清、bFGF、GlutaMAX Supplement、Antibiotic-Antimycotic、0.05%Trypsin-EDTA、消化酶Accutase、Lipofectamine 2000、Opti-MEM(美国Invitrogen公司);抗E-cadherin抗体、抗OCT4抗体(美国Cell Signaling Technology公司);抗Tra-1-60抗体、抗SSEA-4抗体、抗Wnt3a抗体、抗α-SMA抗体(美国Millipore公司);抗β3-tubulin抗体(美国Sigma公司);抗NANOG抗体(美国Peprotech公司);抗AFP抗体(美国Abcam公司)。恒温CO2培养箱、生物安全柜、水浴锅、多功能酶标仪(美国Thermo Fisher公司);正置荧光显微镜、倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验流程

实验流程见图1。

图1 永生化人源饲养层细胞系TWE3R的构建Figure 1 Establishment of immortalized human feeder cell line TWE3R

1.3.2 培养基配置

(1)人间充质干细胞培养基:含10%胎牛血清、1%Antibiotic-Antimycotic和1 ng/mL bFGF的低糖DMEM;(2)293T培养基:含10%胎牛血清的高糖DMEM;(3)人胚胎干细胞培养基:含1% Antibiotic-Antimycotic、1% Lglutamine、1% Nonessential amino acids、20% KNOCKOUT Serum Replacement、0.007‰ β-mercaptoethanol和10 ng/mL bFGF的KNOCKOUT DMEM。

1.3.3 人骨髓间充质干细胞的培养

将人骨髓来源去除CD34阳性细胞的单个核细胞重悬于hMSCs培养基中,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养,每48 h更换培养基,培养14 d左右见明显细胞克隆形成,将细胞进行传代培养。

1.3.4 构建过表达E-cadherin的TWE3R细胞系和空载对照组TWN3R细胞系

将含有Puromycin抗性基因和E-cadherin基因的慢病毒以及仅含有Puromycin抗性基因的慢病毒浓缩液分别感染TW2R细胞系,通过1 μg/mL Puromycin加药筛选,获得稳定过表达E-cadherin基因的细胞系TWE3R和稳定表达Puromycin抗性基因的对照组细胞系TWN3R。

1.3.5 细胞免疫荧光检测

将细胞接种于24孔板中,待细胞贴壁,PBS清洗,4%的多聚甲醛固定,0.3% TritonX-100渗透,5%正常驴血清封闭1 h,一抗4℃孵育过夜(抗Ecadherin抗体1∶200稀释,抗Wnt3a抗体1∶100稀释,抗Tra-1-60抗体1∶300稀释,抗Oct-4抗体1∶400稀释,抗NANOG抗体1∶300稀释,抗SSEA-4抗体1∶100稀释)。PBS清洗后室温避光孵育荧光二抗1.5 h,DAPI染核5 min,置于荧光显微镜下观察。

1.3.6 人胚胎干细胞在不同饲养层细胞上的克隆形成实验

将10 μg/mL丝裂霉素处理的hMSCs、TW2R、TWN3R、TWE3R和CF1 MEF饲养层细胞分别接种于预包被明胶的24孔板中,过夜培养。将无饲养层细胞中培养的H9人胚胎干细胞用Accutase酶消化,制备单细胞悬液,按1、10、100、1×103和1×104细胞密度分别接种到含有不同饲养层细胞的24孔培养板中,培养7 d后,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色,计数阳性克隆数。

1.3.7 人胚胎干细胞在TWE3R饲养层细胞上的长期传代培养以及生物学特性分析

将H9人胚胎干细胞接种于丝裂霉素预处理的TWE3R上并连续传代10代,然后进行相关生物学特性的分析:细胞核型分析、拟胚体形成实验和畸胎瘤形成实验。

(1)细胞核型分析 在对数生长期的TWE3R细胞中加入秋水仙素(Colcemid)细胞培养箱培养40～60 min。DPBS清洗后,胰酶消化离心。加入KCl低渗处理,置于37℃水浴锅中孵育10～15 min,加入固定液(甲醇:冰醋酸=3∶1)进行预固定10 min,离心弃上清。加入固定液固定30 min,离心弃上清,再次加入固定液,4℃固定过夜。将固定好的细胞悬液,滴在玻片上,置于75℃烤箱烘烤3 h。将玻片放在胰酶中消化60 s后,生理盐水漂洗,进行Giemsa混合液染色,自来水冲洗、晾干镜检,共计数30个分裂相,分析3个核型。

(2)拟胚体形成实验 将TWE3R饲养层细胞上连续传代10代的H9人胚胎干细胞接种到低粘附6孔板中,隔天换液,8 d后将形成拟胚体接种于0.1%明胶预处理的24孔板,继续培养2 d后,4%多聚甲醛固定,细胞免疫荧光检测,抗体稀释比例如下:抗β3-tubulin抗体1∶1000稀释、抗AFP抗体1∶500稀释、抗α-SMA抗体1∶500稀释。

(3)畸胎瘤形成实验 在TWE3R饲养层细胞上连续传代培养10代的H9人胚胎干细胞,胶原酶消化,离心后将约5×106细胞重悬于1∶1稀释的Matrigel中,注射于NOD-SCID小鼠的后肢肌肉中,4～8周后将形成的畸胎瘤取出,经4%的多聚甲醛固定,石蜡包埋后进行切片和HE染色。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0进行统计学分析,GraphPad Prism 8.0软件进行图标制作,计量结果以平均数±标准差(±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA),组间两两比较采用t检验,P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 构建永生化人源饲养层细胞TWE3R

前期研究通过先后转染共表达hTERT基因和Hygromycin抗性基因的逆转录病毒载体以及共表达Wnt3a基因和Neomycin抗性基因的逆转录病毒载体的病毒载体到hMSCs细胞,通过体外长期传代培养获得了永生化的人源饲养层细胞系TW2R。在TW2R细胞基础上,通过转染共表达E-cadherin基因和Puromycin抗性基因的慢病毒载体到TW2R细胞,抗性筛选获得了稳定过表达E-cadherin基因的永生化TWE3R细胞系。如图2A中相差显微镜图片所示在细胞形态上TW2R、TWN3R和TWE3R细胞系与原代hMSCs基本相似,细胞呈长梭形。免疫荧光染色结果显示hMSCs不表达Wnt3a蛋白和E-cadherin蛋白。TW2R和TWN3R仅表达Wnt3a蛋白不表达E-cadherin蛋白,TWE3R既表达Wnt3a蛋白也表达E-cadherin蛋白。由于原代hMSCs在连续传5～6代后,其细胞增殖能力开始下降,并开始出现细胞核与细胞质的比率减小等细胞衰老的特征,因此本研究通过对TWE3R细胞进行长期连续传代培养,来观察TWE3R细胞是否会出现细胞衰老的表型,以证实TWE3R是否具有永生化细胞的生物学特点,结果如图2B所示,连续传代中TWN3R和TWE3R细胞的增殖倍增曲线显示,稳定转染E-cadherin基因不会影响TWE3R细胞的增殖能力,对照组的TWN3R细胞和TWE3R细胞的细胞倍增时间在长期连续传代培养过程中无明显改变,两种细胞连续传代50代以上,细胞形态无明显改变,也未出现衰老的表现。细胞染色体核型分析结果如图2C所示,TWE3R细胞具有正常的人染色体细胞核型,无染色体数目或结构异常。

图2 永生化人源饲养层细胞系TWE3R的生物学特性Note.A,Cells morphology observation in phase contrast microscopy images and immunofluorescence staining for Wnt3a(Red)or E-cadherin(Red)and nuclei DAPI(Blue).B,Growth curves of TWN3R and TWE3R on continuous passaging.C,TWE3R maintained a normal karyotype.Figure 2 Characterization of immortalized human feeder cell line TWE3R

2.2 比较人胚胎干细胞在TW2R、TWN3R、TWE3R和MEF细胞上的克隆形成率

由于克隆形成实验通常用来检测细胞的增殖能力,为了证实TWE3R比其亲本细胞和MEF细胞具有更高效率支持人胚胎干细胞增殖的特性,本研究比较了不同细胞密度的H9人胚胎干细胞在TW2R、TWN3R、TWE3R和MEF细胞上的克隆形成率,结果如图3A所示,在TWE3R细胞上,不同密度的H9人胚胎干细胞克隆形成率均高于TW2R、TWN3R和MEF细胞,差异具有统计学意义(P＜0.05),而在TW2R、TWN3R和MEF细胞之间克隆形成率无显著差异(P＞0.05),并且更值得关注的是,TWE3R细胞可支持低密度接种条件下(每平方厘米5个)人胚胎干细胞的生长,而在其他饲养层细胞上几乎观察不到人胚胎干细胞克隆的形成。

2.3 人胚胎干细胞在TWE3R细胞上长期传代培养后的生物学特性的鉴定

H9人胚胎干细胞系是国际上最通用胚胎干细胞系之一,为了证实人胚胎干细胞可在TWE3R细胞上长期传代培养并保持未分化人胚胎干细胞的生物学特点,本研究将H9人胚胎干细胞在TWE3R细胞上连续传代培养10代,分别进行人胚胎干细胞染色体细胞核型分析、特异性标志物的染色、拟胚体形成和畸胎瘤形成实验。为了检测H9人胚胎干细胞在TWE3R细胞上连续传代培养后是否具有正常的二倍体核型,结果如图3B显示连续传代的H9人胚胎干细胞仍然保持正常的染色体细胞核型,无染色体数目或结构异常。如图3C显示,H9人胚胎干细胞在TWE3R细胞上连续传代培养后,H9人胚胎干细胞呈克隆团样生长,克隆边缘清晰,细胞形态均一,核质比高,细胞仍然保持正常未分化的形态,碱性磷酸酶染色呈强阳性。进一步细胞免疫荧光染色结果也显示,连续传代的H9人胚胎干细胞仍然表达多能干细胞特异性标志物Tra-1-60、OCT4、NANOG和SSEA-4。拟胚体形成实验是检测人胚胎干细胞体外多向分化潜能的重要实验,而畸胎瘤形成实验是检测人胚胎干细胞体内多向分化潜能的重要实验,本研究结果如图3D显示,由连续传代的H9人胚胎干细胞体外分化形成的拟胚体表达外胚层标志物(β3-tubulin),中胚层标志物(α-SMA)和内胚层标志物(AFP)。此外,H9人胚胎干细胞在TWE3R传10代后,注射到免疫缺陷小鼠体内,可形成畸胎瘤,并且畸胎瘤HE染色显示肿瘤组织含有来自外胚层、内胚层和中胚层的组织,表明H9人胚胎干细胞细胞在TWE3R饲养层细胞上长期传代后仍然保持体内、体外向3个胚层分化的能力。

图3 TWE3R可支持未分化状态人胚胎干细胞的长期传代培养Note.A,H9 hESCs plated on TWE3R feeders showed a higher efficiency of clonal growth than those on TW2R,TWN3R or MEF.Compared with TW2R,*P＜0.05.Compared with TWN3R or MEF,**P＜0.01.B,After 10 passages on TWE3R,the H9 hESCs maintained a normal female karyotype and undifferentiated morphology and expression of pluripotency markers such as SSEA4,TRA-1-60,OCT4,NANOG and alkaline phosphatase.D,Potential to differentiate to derivatives of all three embryonic germ layer in vivo(right panel)and in vitro(left panel)in embryoid body formation assays and teratoma formation assays.Figure 3 TWE3R human feeders support long-term culture of undifferentiated human ESCs

3 讨论

人胚胎干细胞具有体外无限增殖、保持未分化状态的自我更新能力和多向分化潜能的一类细胞。干细胞生长所处的微环境,在调节干细胞活性和行为方面发挥着主导作用,主要包括细胞间的相互作用和细胞与细胞外基质间的相互作用。细胞之间的相互作用通过3种方式介导:可溶性因子、细胞外矩阵(ECM)和细胞间粘附。其中细胞间粘附是调节细胞的分化和增殖的重要因素[27-28]。

E-cadherin是钙依赖性黏附分子的亚族成员,是一种跨膜蛋白,广泛分布在非神经上皮组织,它与细胞内的特异性分子结合,参与同种亲和性的细胞-细胞间的黏附,胚胎发育以及正常组织中上皮细胞层的形成和维持[29]。在胚胎发育过程的早期,研究显示E-cadherin介导的细胞与细胞间黏附作用参与了细胞的迁移和组织的形成[30]。此外,有研究显示E-cadherin在维持多能干细胞的生长方面也有着重要作用。Nagaoka等[31-32]研究报道,包被了E-cadherin蛋白膜外部分的培养表面能够充分维持小鼠胚胎干细胞和人多能干细胞的生长,并可维持多能干细胞的全部生物学特性,这说明E-cadherin不但是一个细胞黏附分子,同时可能也起到了激活维持多能干细胞多能性信号通路的作用。Chen等[33]研究报道,在小鼠成纤维细胞重编成为诱导多能干细胞的过程中下调内源性E-cadherin表达,可使重编程的效率降低80%,并且证明E-cadherin所介导的细胞间黏附作用在体细胞重编程为诱导多能干细胞的过程中起到至关重要的作用。由于体细胞重编程为诱导多能干细胞是小概率事件,因此如何提高重编程过程中单个诱导多能干细胞的存活率,对于诱导多能干细胞的应用有着重要意义。已知ES细胞和诱导多能干细胞表达E-cadherin,而饲养层细胞不能表达E-cadherin。先前已有研究报道,单个人胚胎干细胞由于不能及时重建Ecadherin所介导的细胞与细胞间的相互黏附作用,而易发生凋亡,导致细胞自我更新能力的下降和细胞死亡的增加[34]。文献报道hMSCs不能表达Ecadherin[35],我们研究发现饲养层细胞hMSCs以及永生化TW2R细胞均不表达E-cadherin。由于ES细胞和诱导多能干细胞表达E-cadherin,因此提出本研究假设,在饲养层细胞过表达E-cadherin基因可通过增强多能干细胞和饲养层细胞间的相互作用来提高多能干细胞的自我更新和存活能力。本研究显示,通过在前期建立的永生生化TW2R细胞上过表达E-cadherin,可获得永生化的人源饲养层细胞系TWE3R,人胚胎干细胞在TWE3R细胞上克隆形成率均明显高于其亲本细胞(TW2R)和对照组细胞(TWN3R),并且具备特异性支持低密度接种条件下(每平方厘米5个)的生长,而MEF、TW2R和TWN3R不具备这种能力,这说明人胚胎干细胞在被消化成单个细胞后在低密度下具有较差的克隆形成能力,而过表达E-cadherin的TWE3R可以显著提高其单细胞存活率和克隆形成率。其机制可能与E-cadherin调控其下游信号分子β-catenin有关,而β-catenin是Wnt信号系统下游的关键分子,其可通过调控细胞内Nanog和OCT-4基因的表达和分布影响胚胎干细胞的增殖和多能性维持[36-38]。此外,人胚胎干细胞在TWE3R上连续传代培养过程中,细胞仍然保持正常未分化的形态,保持正常的染色体细胞核型,表达干细胞标志物Tra-1-60、OCT4、NANOG和SSEA-4[39],在体外拟胚体实验和体内畸胎瘤实验证实所培养的人胚胎干细胞保持体内、体外向3个胚层分化的能力。

综上所述,本研究所建立的过表达E-cadherin的永生化人源饲养层细胞系TWE3R高效支持人胚胎干细胞未分化状态生长的优势,是理想的人源饲养层细胞,为解决人胚胎干细胞体外培养和临床应用时面临的一系列问题提供了新的解决方案。