胰腺癌组织中SOX4和E-cadherin的表达及临床意义

秦 雯，陈泰文，郑海平，陶慧娟，朱小东

胰腺癌患者死亡的主要原因是早期症状不明显，确诊时癌细胞已向局部进展或远处转移，错过最佳治疗机会。因此，测定胰腺癌转移的生物指标，明确其转移机制，是临床制定合理的胰腺癌抗肿瘤治疗方案、改善胰腺癌患者预后的研究热点之一。目前认为在癌症背景下，上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)可以驱动肿瘤转移[1-2]、肿瘤复发[3]和肿瘤治疗耐药[4]。肿瘤发生EMT的同时往往伴随其相关分子标志物表达的变化，如在子宫内膜癌[5]、乳腺癌[6]、口腔鳞状细胞癌[7-8]、前列腺癌[9]、胃癌[10]、食管癌[11]、肺癌[12-13]等肿瘤中SOX4表达与EMT密切相关。此外，有研究推测在胰腺癌中，EMT可能催生了以E-cadherin下调、细胞骨架重组、运动和侵袭潜能为特征的癌细胞转移表型，E-cadherin可能发挥着EMT轴标志物的作用[14]。目前胰腺癌组织中SOX4、E-cadherin蛋白表达及其临床意义尚不明确，两者之间的关系也不明确。本实验采用组织芯片技术和免疫组化SP法检测胰腺癌组织中SOX4和E-cadherin蛋白的表达，探讨在胰腺癌发生和演进过程中EMT的改变，以进一步揭示胰腺癌的发生、发展机制。

1 材料与方法

1.1 材料收集2015年1月～2018年1月广西医科大学第一附属医院、广西医科大学附属肿瘤医院、广西医科大学附属武鸣医院收治的合计125例胰腺癌组织及对应癌旁正常胰腺组织，其中癌旁组织距癌灶距离>2 cm。125例经病理检查证实均为胰腺导管腺癌，其中男性69例，女性56例，年龄(62.06±8.27)岁；患者术前均未接受任何辅助治疗，其中病变位于胰头者79例，位于胰体尾者46例；根据1997年国际抗癌联盟(UICC)的病理分级标准：高、中、低分化胰腺导管腺癌分别为21、55、49例；肿瘤分期采用2018版美国癌症联合委员会(AJCC)推出的胰腺癌分期系统：Ⅰ期23例，Ⅱ期50例，Ⅲ期38例，Ⅳ期14例；伴淋巴结转移者62例，无淋巴结转移者63例。本实验经广西医科大学附属武鸣医院伦理委员会批准同意。

1.2 组织芯片构建组织芯片制作实验在广西医科大学实验中心进行。依据HE染色切片选取相应的组织蜡块，镜下观察切片，并确定具有代表性的病变部位。制作组织芯片的取样针直径1.5 mm，组织芯间距1.0 mm，使用的仪器为组织芯片构建仪(Beecher Instruments，Silver Spring, MD)。

1.3 免疫组化采用免疫组化SP法检测SOX4及E-cadherin蛋白表达。兔抗人SOX4多克隆抗体和兔抗人E-cadherin多克隆抗体均购自Origene公司，SP免疫组化超敏试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新公司。用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，用已知阳性标本作为阳性对照，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.4 结果判定SOX4以细胞核(或细胞核和细胞质)出现弥漫均匀的淡黄色至棕褐色颗粒为阳性，E-cadherin以细胞膜出现棕褐色的线状染色为阳性。由两名病理科医师独立完成阅片和判读，每张切片随机选取5个高倍视野，每个视野计数200个细胞。根据阳性细胞染色强度计分：未着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据阳性细胞百分率计分：阳性细胞数≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将两项得分结果相乘：0～2分为阴性，3～12分为阳性。

1.5 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学处理。SOX4及E-cadherin表达与胰腺癌临床病理特征的相关性采用χ2检验；SOX4与E-cadherin表达的相关性用Spearman秩相关检验；采用Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析；单因素及多因素生存分析采用Cox比例风险模型。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌组织和癌旁组织中SOX4、E-cadherin蛋白的表达SOX4蛋白表达主要定位于细胞核(或细胞核和细胞质)，呈弥漫均匀的淡黄色至棕褐色颗粒，E-cadherin蛋白表达主要定位于细胞膜，呈淡黄色至棕褐色(图1)。125例胰腺癌组织中97例(77.6%)SOX4蛋白阳性，癌旁组织中15例(12.0%)SOX4蛋白阳性；125例胰腺癌组织中18例(14.4%)E-cadherin蛋白阳性，癌旁组织中103例(82.40%)E-cadherin蛋白阳性。胰腺癌组织中，SOX4蛋白阳性率高于癌旁组织，E-cadherin蛋白阳性率低于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 胰腺癌组织及癌旁组织中SOX4及E-cadherin的表达[n(%)]

2.2 胰腺癌中SOX4、E-cadherin表达与临床病理特征的关系胰腺癌组织中，SOX4蛋白表达与肿瘤大小、肿瘤部位、AJCC分期、淋巴结转移、脉管内癌栓和神经侵犯相关(P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤分化程度无关(P>0.05)。E-cadherin蛋白表达与肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤分化程度、AJCC分期、淋巴结转移、脉管内癌栓和神经侵犯相关(P<0.05)，与患者性别、年龄无关(P>0.05，表2)。

表2 胰腺癌组织中SOX4、E-cadherin表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 胰腺癌中SOX4和E-cadherin蛋白表达的相关性Spearman相关性分析显示，SOX4和E-cadherin共同阳性者1例，共同阴性者11例，SOX4阳性而E-cadherin阴性者96例，SOX4阴性而E-cadherin阳性者17例，两者在胰腺癌中的表达呈负相关(r=-0.763，P<0.001，表3)。

表3 胰腺癌中SOX4和E-cadherin表达的相关性

2.4 SOX4和E-cadherin蛋白表达与胰腺癌患者生存期的相关性Kaplan-Meier生存分析及Log-rank检验显示，SOX4蛋白阳性或E-cadherin蛋白阴性患者的生存期显著缩短(P<0.001，图2)。Cox单因素分析显示，肿瘤大小、分化程度、AJCC分期、淋巴结转移、脉管内癌栓、神经侵犯、SOX4蛋白表达及E-cadherin蛋白表达与患者生存期有关(P<0.05)；Cox多因素分析显示，AJCC分期、肿瘤大小、远处转移是影响患者生存的独立预后因素(表4、5)。

表4 胰腺癌患者的Cox单因素相关性分析

表5 胰腺癌患者的Cox多因素相关性分析

图2 Kaplan-Meier生存曲线分析SOX4(A)、E-cadherin(B)

3 讨论

1982年Greenburg和Hay[15]首次描述了EMT，指静止的、极化的上皮细胞“转化”为高度运动的、伸长的间质细胞能力；并初步描述了EMT在胚胎期神经嵴、心内膜垫形成过程中的功能，以及在成人组织伤口愈合和组织重塑过程中的功能。有趣的是，不恰当地重新激活胚胎发育过程和成人组织生长过程的EMT，与人类恶性肿瘤的发生、发展有关。之后大量研究进一步证实，EMT是上皮细胞失去细胞极性和细胞黏附而获得间质特征的过程，也是癌细胞获得侵袭和迁移能力的首要环节[1-2]。当细胞发生EMT时，可能伴随着其相关分子标志物的表达变化[16]。在多种肿瘤中SOX4、E-cadherin蛋白表达与EMT密切相关[5-14]。

Sox(Sry-related high-mobility group box)转录因子家族成员几乎存在于所有的细胞、组织和器官中，在细胞生长和胚胎发育中发挥重要的功能。SOX4基因属于SOX家族的C组成员，定位于6p22.3上，编码一种由474个氨基酸组成的、主要定位于细胞核内的蛋白质，即SOX4蛋白。SOX4蛋白主要由N端HMG结构域和C端转录激活结构域(transactivation domain,TAD)组成，可通过高度保守的HMG结构域与DNA结合来激活或抑制靶基因的表达，也可与其他转录因子相互作用共同调节基因的表达。SOX4在多种肿瘤中过表达，并能通过调节EMT促进肿瘤的转移。如在乳腺上皮细胞中SOX4参与了转录生长因子β(transforming grows factor β, TGF-β)介导的EMT，敲除SOX4基因则能够阻断EMT[6]。

E-cadherin是一种经典的钙依赖性黏附分子家族成员，在正常组织和细胞的生长、分化、凋亡和形态学改变中发挥关键作用。E-cadherin蛋白促进相邻细胞间稳定连接的形成，促进上皮细胞黏附，并保持组织结构和功能的完整性。此外，E-cadherin还能抑制肿瘤细胞分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)。因此，E-cadherin蛋白表达缺失降低了肿瘤细胞之间的相互黏附力，使其能够突破细胞外基质和基膜，脱离原发肿瘤，发生侵入和转移。E-cadherin作为一种非常敏感的EMT标志物，其表达与肿瘤细胞的浸润和未分化表型有关，与早期肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关。E-cadherin表达下调被认为是EMT过程中的关键事件[14]。

EMT也是胰腺癌早期侵袭和转移的重要分子机制。本实验选择胰腺癌作为研究对象，对EMT相关蛋白SOX4和E-cadherin表达进行检测和分析，结果显示，SOX4在胰腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，且肿瘤临床分期越高、肿瘤体积越大，其SOX4表达越高；此外，存在淋巴结转移、脉管内癌栓或神经侵犯者，其SOX4表达亦增高。E-cadherin在胰腺癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织，且肿瘤临床分期越高、肿瘤体积越大、肿瘤分化程度越低，其E-cadherin表达越低；此外，存在淋巴结转移、脉管内癌栓或神经侵犯者，其E-cadherin表达也降低。这说明胰腺癌的发生是渐进的过程，SOX4和E-cadherin可能参与胰腺癌的发展和转移，且两者在胰腺癌组织中的变化趋势相反。生存分析显示，SOX4蛋白阴性组与阳性组相比具有生存优势，生存期相对延长；E-cadherin蛋白阳性组与阴性组相比具有生存优势，生存期相对延长。Cox单因素生存分析亦显示，EMT相关蛋白SOX4及E-cadherin的表达与患者生存期有关。因此，有可能通过联合检测SOX4及E-cadherin表达来判断胰腺癌的预后。此外，EMT过程具有可塑性，可通过诱导间质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition, MET)来逆转。因此，增强对EMT如何启动和逆转，以及如何调控的认识，对于降低肿瘤转移相关的病死率至关重要。

综上所述，利用组织芯片和免疫组化法检测胰腺癌组织中EMT相关蛋白SOX4及E-cadherin的表达，不仅为进一步揭示胰腺癌的发生、发展机制及患者预后判断提供参考依据，而且在调控和逆转EMT、预防和治疗胰腺癌方面也具有重要的临床指导意义。