EGFL6在胃癌血管生成中的作用

门 慧，谈 顺

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，转移是胃癌患者死亡的重要原因。探讨胃癌发生、发展相关的分子机制从而寻求有效的治疗手段是现阶段研究的重要任务[1-2]。肿瘤微环境是肿瘤细胞赖以生存的土壤，肿瘤侵袭、转移需要新生血管支持，而血管内皮细胞是血管形成的基础[3]。EGFL6属于EGF重复超级家族，是一种分泌蛋白，特征是EGF结构域重复，由于同时具有EGF结构域和MAM结构域，又被命名为MAEG，参与细胞周期、增殖及发育调节[4]。文献报道，EGFL6在多种肿瘤中表达上调，并促进肿瘤血管形成：如EGFL6促进乳腺癌侵袭、转移及血管形成[5]；EGFL6能促进卵巢癌[6]、结直肠癌[7-9]侵袭、转移；EGFL6在黑色素瘤[10-11]、鼻咽癌[12]、口腔鳞状细胞癌[13]、肺腺癌[14]中高表达；EGFL6促进斑马鱼胚胎血管形成[15]。迄今为止，EGFL6在胃癌微环境中的生物学作用尚未见报道。本文着重探讨EGFL6在胃癌血管生成中的作用，为临床肿瘤治疗提供新的分子治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器细胞株、胃癌组织均来自中南大学湘雅医学院附属海口医院，RPMI 1640培养基、胎牛血清购自BI生物公司，0.25%胰酶购自Life公司，EGFL6多克隆抗体购自Abcam公司，CD34抗体购自福州迈新公司，过表达质粒购自广州锐博公司，慢病毒上清自提，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒及蛋白浓度测定试剂盒购自Bioword公司，5×SDS蛋白上样缓冲液、ECL化学发光液、全蛋白提取试剂盒购自凯基生物公司，电泳仪购自BAYGENE公司，低温高速离心机购自Thermo公司，蛋白浓度的酶标仪购自BIO-BRAD公司，分光光度计及低温离心机购自Thermo公司。Trizol试剂、逆转录试剂盒、荧光定量试剂购自TaKaRa公司，β-actin单克隆抗体购自北京中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 胃癌细胞株及人类血管内皮细胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培养基置于37 ℃ 5%CO2培养箱中培养，选择状态佳的细胞株用于实验。

1.2.2EGFL6过表达稳定株构建 提前48 h铺工具细胞293T于75 cm2培养瓶中，至细胞融合度达70%左右，细胞液换成无血清RPMI 1640培养基，取2.5 μg EGFL6质粒、5 μL HIV包装质粒混合液于1.5 mL无菌EP管，加入Opti-Mem液至200 μL；加入15 μL EndoFection转染试剂于1.5 mL无菌EP管，加入Opti-Mem至200 μL，将本次200 μL混合液加入前一支1.5 mL EP管，混匀，静置20 min。然后再把混合液加入293T细胞中，再加入1/500总体积的Titerboost增强剂。细胞培养箱内培养12 h，用含5%胎牛血清RPMI 1640培养基换液(内含有双抗1 ∶100比例配置)，继续培养48 h，取病毒上清，离心、过滤，-80 ℃保存。前一天铺MGC803细胞于6孔板中，至细胞融合度约70%，用已收集好的病毒上清换液，每孔1 mL，继续培养36 h，用含5%胎牛血清RPMI 1640培养基换液(内含有双抗1 ∶100比例配置)，培养至细胞长满，用含有嘌呤霉素的培养基药筛，最后扩大培养。

1.2.3RT-PCR (1)细胞及组织总RNA提取：细胞生长铺满瓶底，PBS洗3次，每10 cm2瓶壁面积加入1 mL Trizol试剂，于冰上裂解5 min，0.2 mL氯仿/1 mL Trizol比例加入氯仿，混匀冰上置2～3 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，上层水相转移至去酶1.5 mL离心管，沉淀RNA中加入等体积异丙醇，室温静置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，除上清，收沉淀，DEPC处理过的水配制75%乙醇洗涤，离心，室温放置自然干燥，DEPC水溶解RNA，测RNA浓度。组织总RNA提取：研钵洗净置180 ℃烤箱烘烤5 h，冷却备用，研钵中加入适量的液氮，将组织剪约绿豆大小研磨成粉末状，加入Trizol 1 mL匀浆裂解，裂解物移至DEPC水处理过的1.5 mL微离心管中，余步骤同前。(2)逆转录反应：按TaKaRa逆转录试剂盒说明书加入相应试剂配制反应体系，37 ℃反应15 min，85 ℃灭活5 min，反转录产物用DEPC水稀释约4倍，-20 ℃保存，备用。(3)RT-PCR反应：EGFL6引物序列：上游5′-AG GCATCACGGGTTGTTAGC-3′；下游5′-CGTAGCAG CAGGCCAGTTTAG-3′，根据TaKaRa RT-PCR试剂盒说明书配制反应体系，95 ℃预变性10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃约30 s、72 ℃ 34 s，合计40个循环。7500 Fast Real-time PCR仪取得各模板Ct值，以Folds=2-ΔΔCt代表实验组及对照组目的基因表达关系。

1.2.4Western blot法 (1)蛋白浓度测定-BCA法：采用Bioworld公司BCA Protein Assay Reagengt Kit进行检测。酶标仪器测量570 nm处吸光度值(OD值)，测量蛋白浓度。(2)Western blot：配制10%SDS-PAGE分离胶、5%SDS-PAGE浓缩胶，每个泳道上样量40 μg，进行电泳。根据蛋白Marker位置切目的条带，Bio-Rad微型电转系统，200 mA电流，冰上转膜，条带封闭(含约5%脱脂奶粉或血清的PBST)1 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜。PBST洗膜，加入HRP标记抗兔二抗，室温孵育约1 h，PBST洗膜。于化学发光仪中进行发光。

1.2.5条件培养基的制备 胃癌细胞株置于75 cm2的培养瓶，长满至瓶底面积80%～90%，PBS洗2次，改用无血清RPMI 1640培养基继续培养24 h，吸取细胞培养液至无菌离心管，离心、弃沉淀，取上清，置于-80 ℃中保存备用。

1.2.6鸡胚尿囊膜实验 取6～7日龄的鸡胚，在超净台内用有齿小镊钝头在气室中心敲开一个直径约1 cm小洞，将直径约0.8 cm无菌的橡胶圈放入已暴露好的鸡胚尿囊膜表面，条件培养基约200 μL加入橡胶圈中，医用胶白布封口，置于37 ℃、80%湿度的孵箱内孵育48～72 h。取出处理好的鸡胚，将丙酮与甲醇混合液(1 ∶1比例配置)滴入尿囊膜表面，固定15 min，尿囊膜轻轻剪下来，生理盐水浸泡，捞片、摊片，拍照。

1.2.7小管形成实验 人脐静脉血管内皮细胞HUVEC饥饿过夜，将Matrigel基质胶铺于24孔板，每孔200 μL，37 ℃细胞培养箱30 min，每孔铺2×104个HUVEC细胞于基质胶上并加入200 μL条件培养基，于37 ℃ 5%CO2细胞培养箱孵育12 h，镜下观察小管形成情况。

1.2.8Transwell迁移实验 人脐静脉血管内皮细胞HUVEC饥饿过夜，将600～800 μL条件培养基加入24孔板下室中，上室加约200 μL细胞悬液，每个小室加入2×105个细胞，置37 ℃ 5%CO2培养箱培养约12 h。取出小室，用PBS液冲洗小室3次，经10%中性福尔马林固定，苏木精染色。显微镜下观察穿过膜的细胞数，取上、下、左、右、中5个视野，计数穿过膜细胞数。

1.2.9免疫组化 采用免疫组化SP法染色。具体步骤：烤片、脱蜡、抗原修复、阻断灭活内源性过氧化物酶、山羊血清工作液封闭、一抗4 ℃冰箱孵育过夜、生物素标记二抗、辣根过氧化物酶孵育、DAB显色、苏木精染色、脱水、透明、干燥、封固定。判断标准[16]：(1)按细胞着色强度计分：未着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分；(2)按阳性细胞所占百分比计分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；将两项得分结果相加：3～4分为低表达，5～7分为高表达。微血管密度(microvessel density, MVD)计数[16-18]：取3个肿瘤血管密度最高的热点区(100×)，在这3个热点区随机计数5个视野微血管数目(200×)，取5个视野微血管数目均值为本例的MVD(微血管是指管腔直径约>8个红细胞直径的总和)。

1.3 统计学分析采用Graphpad Prism统计软件进行统计学分析，两组均数间比较采用配对样本t检验，生存率的比较采用Mantel-Cox检验，取α=0.05为检验标准。

2 结果

2.1 胃癌组织中EGFL6 mRNA的表达RT-PCR技术检测40例配对新鲜胃癌组织中EGFL6 mRNA表达，与周围正常胃黏膜组织比较，胃癌组织中EGFL6 mRNA高表达31例，低表达9例。结果显示与周围正常胃黏膜组织相比，胃癌组织中EGFL6 mRNA表达水平明显上调(P<0.05，图1)。

图1 RT-PCR技术检测40例新鲜配对胃癌组织中EGFL6 mRNA的表达水平：

2.2 EGFL6表达与胃癌患者预后的相关性利用Kaplan-Meier生存曲线分析EGFL6表达与胃癌患者5年生存时间的关系，31例高表达组患者的中位生存时间为36个月，9例低表达组患者的中位生存时间为48个月。EGFL6高表达患者5年生存率明显低于EGFL6低表达患者(P<0.05，图2)。

图2 Kaplan-Meier生存曲线分析EGFL6表达与胃癌患者5年生存率的关系

2.3 胃癌组织中EGFL6的表达与肿瘤MVD计数的关系免疫组化结果显示，在胃癌组织中EGFL6高表达39例，低表达11例，高表达组MVD计数平均为(36.46±0.71)个/HPF，低表达组MVD计数平均为(16.64±0.92)个/HPF(图3A～D)；EGFL6高表达组的MVD计数明显高于低表达组(P<0.05，图3E)。

图3 A.EGFL6在胃癌组织中高表达；B.EGFL6高表达胃癌组织中的MVD;C.EGFL6在胃癌组织中低表达;D.EGFL6低表达胃癌组织中的MVD;E.EGFL6高表达组与低表达组MVD计数统计图

2.4 Western blot法及RT-PCR技术检测胃癌细胞株中EGFL6内源性表达Western blot法及RT-PCR检测3株胃癌细胞株AGS、BGC823、MGC803中EGFL6的表达水平，结果显示EGFL6在MGC803细胞中表达水平最低(图4)。

图4 A.Western blot法检测3株胃癌细胞株中EGFL6蛋白表达；B.RT-PCR技术检测3株胃癌细胞株中EGFL6 mRNA表达

2.5 Western blot法及RT-PCR技术检测慢病毒感染效率Western blot法及RT-PCR技术检测EGFL6慢病毒过表达载体感染MGC803细胞后EGFL6水平，结果显示：MGC803/MOCK组及MGC803/EGFL6组带有绿色荧光的病毒载体成功转入胃癌细胞株中(图5A)；与MGC803/MOCK组相比，MGC803/EGFL6组EGFL6的蛋白及mRNA水平均明显上调(图5B、C)，两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

图5 A.荧光显微镜检测目的病毒载体成功转入胃癌细胞株中;B.Western blot法检测MGC803/EGFL6稳定细胞株构建效率;C.RT-PCR技术检测MGC803/EGFL6稳定细胞株构建效率

2.6 Western blot法检测条件培养基中EGFL6蛋白表达Western blot法检测结果显示，与MGC803/MOCK组相比，MGC803/EGFL6组蛋白表达水平明显上调(图6)。

图6 Western blot法检测条件培养基中EGFL6蛋白表达

2.7 血管形成实验鸡胚尿囊膜实验、小管形成实验及内皮细胞迁移实验观察EGFL6促进体内、外血管形成情况，与MGC803/MOCK组相比，MGC803/EGFL6组体内、外血管形成能力明显增加(图7)，两组相比差异有统计学意义(P<0.05)；提示EGFL6能够促进体内、外血管形成能力。

图7 A.鸡胚尿囊膜实验观察体内血管形成能力;B.小管形成实验观察体外血管形成能力;C.内皮细胞迁移实验观察体外血管形成能力;D.内皮细胞穿过小室膜数量统计图

3 讨论

胃癌是全球发病率和病死率均较高的恶性肿瘤之一。由于其复发率及转移率均较高，患者预后较差。肿瘤侵袭、转移是一个多因素、多阶段复杂的病理过程，需要多种基因相互调控协助工作，肿瘤细胞转移需要新生血管的形成，为其提供各种细胞因子及营养成分。生理情况下，机体仅在需要时才会有新生血管形成，而在肿瘤发生、发展时这种平衡状态

会被打破，最终使得肿瘤内血管不断形成。目前胃癌的治疗在手术、放化疗等方面取得了较大进展，但生存率结果依然不容乐观，而抗肿瘤血管生成治疗在胃癌治疗中起重要作用[19-23]。

EGFL6蛋白是EGF重复超级家族中的一员，其特征是EGF结构域重复，由于同时具有EGF结构域和MAM结构域，又被命名为MAEG，参与细胞周期、增殖及发育调节，由于包括了1个N端信号肽，所以是一种分泌蛋白。EGFL6与乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、结直肠癌、鼻咽癌等肿瘤均密切相关，EGFL6促进乳腺癌侵袭、转移及血管形成，EGFL6通过p-ERK促进骨微环境血管生成从而促进骨质愈合[24]，EGFL6促进斑马鱼胚胎血管形成，同家族成员EGFL7可以促进胰腺癌细胞侵袭、转移及血管形成，促进神经胶质瘤及肾细胞癌血管形成[25-27]，EGFL6在胃癌微环境中的作用至今尚未见文献报道。

本实验通过RT-PCR技术检测发现胃癌组织中的EGFL6 mRNA表达水平上调，Kaplan-Meier生存曲线分析显示，EGFL6表达与胃癌患者5年生存率呈负相关。采用免疫组化法检测胃癌组织中EGFL6蛋白表达，并利用CD34计数MVD，结果显示高表达EGFL6组MVD计数明显增多，说明EGFL6有促进胃癌组织血管形成的趋势。为了验证这一现象，本实验采用血管形成实验进一步分析，选取内源性表达较低的胃癌细胞株MGC803进行EGFL6慢病毒过表达细胞株构建，RT-PCR及Western blot法检测结果显示，过表达细胞株构建成功。收集过表达MGC803/EGFL6胃癌细胞株条件培养基，Western blot法检测结果显示，条件培养基制备成功。利用血管形成实验(鸡胚尿囊膜实验、小管形成实验及内皮细胞迁移实验)检测胃癌组织中血管生成情况，结果显示EGFL6促进胃癌血管形成。

本实验结果表明，EFGL6在胃癌中高表达，与患者预后呈负相关，并能促进胃癌血管形成，但EGFL6在胃癌组织中促进血管形成具体作用机制及信号通路仍不清楚，有待后续实验深入探究。EGFL6有望成为肿瘤标志物的筛查指标，为临床肿瘤诊治及新药研究提供新的靶点依据，更好的服务于患者。