结直肠癌组织中FAP-α的表达及临床意义

李育刚，许晴晴，魏珊珊

成纤维细胞激活蛋白-α(fibroblast activation protein-α, FAP-α)是一种新发现的促肿瘤生长因子，在肿瘤生长、浸润和转移、内皮细胞增殖以及新生血管生成等多种生物学行为中发挥重要作用[1]。现阶段FAP-α已被证实在肺癌、食管癌以及胃癌等肿瘤中高表达，与患者预后密切相关，而FAP-α在结直肠癌中的研究较少[2-4]。本实验采用免疫组化ELPS法检测FAP-α蛋白在结直肠癌组织中的表达，探讨其与结直肠癌临床病理特征的相关性及患者预后的影响。

1 材料与方法

1.1 临床资料选取TCGA数据库来源的结直肠癌组织中level 3 HTSeq-FPKM格式的数据和临床数据作为在线数据库研究对象，包含698例结直肠癌标本。选取2015年4月～2017年4月我院存档的118例结直肠癌术后病理切片和临床资料。所有患者通过电话或门诊随访3年，随访截至2020年4月30日。其中男性68例，女性50例，年龄42～68岁，平均(54.42±5.12)岁。同时选取上述病例中30例结直肠癌患者的癌旁组织，纳入28例混合痔患者术后正常黏膜组织和31例内镜下行结直肠息肉切除术后的结直肠腺瘤组织，作为对照组。本实验通过鄂东医疗集团黄石市中心医院伦理委员会审核给予免除签署知情同意书。纳入标准：(1)结合临床特点及术后病理明确诊断为原发性结直肠癌。(2)既往未曾罹患肿瘤或自身免疫性疾病。(3)术后生存时间≥3个月，有完整的临床随访资料。排除标准：(1)合并其他类型肿瘤；(2)未行结直肠癌根治术；(3)术前曾接受过放、化疗或中医治疗；(4)肿瘤以外其他原因导致的患者死亡。

1.2 方法

1.2.1样品采集及保存 结直肠癌、癌旁、正常黏膜和腺瘤组织标本，均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，用于免疫组化染色。

1.2.2生物信息学数据库分析 通过基因表达谱数据动态分析(GEPIA)网站(http: //gepia2.cancer-pku.cn)分析FAP-α在结直肠癌中的表达水平[5]。以FAP-α中位水平为界分为FAP-α低表达和FAP-α高表达，使用survminer和survival R语言包进行生存资料的预后分析[6]。

1.2.3免疫组化 采用免疫组化ELPS法检测结直肠癌、癌旁、正常黏膜、腺瘤组织中FAP-α的表达。操作步骤严格按试剂盒说明书进行，将5 μm厚的组织切片脱蜡水化，用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，在柠檬酸(pH 6.0，0.01 mol/L，95 ℃)中加热15 min，然后缓慢冷却修复抗原。封闭液37 ℃孵育30 min，加入anti-FAP-α抗体4 ℃过夜。次日加二抗37 ℃孵育20 min，经二氨基联苯胺法显色，苏木精复染后，脱水封固定，荧光倒置生物显微镜下观察阳性染色程度。由至少两位病理医师对阳性细胞染色强度和阳性细胞百分比进行独立评估：(1)根据阳性细胞染色强度评分：未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。(2)根据阳性染色细胞百分比评分：阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将两项得分结果相乘：0～4分为低表达，5～10分为高表达。

1.2.4主要试剂与仪器 甲醛、HE染液，购自上海谷研公司。二氨基联苯胺、3%过氧化氢，购自上海研生公司。anti-FAP-α抗体购自上海户实公司，生物组织包埋机购自济南欧莱博公司，荧光倒置生物显微镜购自赛默飞世尔公司。

1.2.5观察指标 比较正常黏膜组织、癌旁组织、腺瘤组织和结直肠癌组织中FAP-α的表达；FAP-α表达与结直肠癌临床病理特征之间的相关性；分析FAP-α表达与患者预后的相关性。

2 结果

2.1 TCGA数据库结直肠癌组织中FAP-α的表达TCGA数据库分析显示，与正常组织相比，FAP-α在结直肠癌组织中的表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05，图1A)。预后生存曲线分析显示，FAP-α低表达组的预后显著优于FAP-α高表达组，差异有统计学意义(P<0.05，图1B)。

图1 TCGA数据库结直肠癌组织中FAP-α的表达(A)及预后分析(B)

2.2 不同结直肠组织中FAP-α的表达免疫组化结果显示，结直肠癌组织中FAP-α高表达组75例，FAP-α低表达组43例。结直肠癌组织中FAP-α的免疫组化得分显著高于正常黏膜组织、癌旁组织、腺瘤组织，差异均有统计学意义(P<0.001)。癌旁组织中的FAP-α的免疫组化得分亦显著高于正常黏膜组织和腺瘤组织，差异均有统计学意义(t=14.01，t=6.64，P<0.05，表1，图2)。

表1 结直肠癌组织、正常黏膜组织、癌旁组织及腺瘤组织中FAP-α的表达[n(%)]

ABCDE图2 不同结直肠组织中FAP-α的表达:A.正常黏膜组织中FAP-α不表达;B.癌旁组织中少数细胞弱表达FAP-α;C.腺瘤间质中少数细胞中等强度表达FAP-α;D.结直肠癌组织中FAP-α低表达;E.结直肠癌组织中FAP-α高表达,ELPS法

2.3 结直肠癌组织中FAP-α蛋白表达与临床病理特征的关系相关性分析结果显示，FAP-α表达与结直肠癌淋巴结转移和脉管侵犯有关，高表达组的淋巴结转移和脉管侵犯的比例均显著高于低表达组(χ2=21.912，χ2=5.591，P均<0.05)，其表达与患者年龄、性别、BMI、ECOG评分、原发灶部位、浸润深度、肿瘤直径、分化程度、神经侵犯、病理分型、RAS突变、手术时间均无关(P均>0.05，表2)。

表2 结直肠癌组织中FAP-α表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.4 结直肠癌中FAP-α表达与患者预后的关系术后随访3年，FAP-α高表达组患者的病死率为37.33%，FAP-α低表达组患者的病死率为18.6%，差异有统计学意义(P=0.033)。结直肠癌患者的平均总生存期(overall survival, OS)为(30.12±5.26)个月，平均无进展生存期(progression-free survival, PFS)为(28.32±5.51)个月。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，FAP-α高表达组的OS显著低于FAP-α低表达组(t=5.232，P<0.001，图3)。此外，FAP-α高表达组患者的PFS亦显著低于FAP-α低表达组(t=5.317，P<0.001，图4)。

图3 Kaplan-Meier生存曲线分析FAP-α表达与结直肠癌患者总生存期的关系

图4 Kaplan-Meier生存曲线分析FAP-α表达与结直肠癌患者无进展生存期的关系

3 讨论

肿瘤相关纤维母细胞(tumor associated fibroblasts, CAF)是肿瘤微环境中最常见的肿瘤基质细胞之一。通过分泌细胞因子、生长因子、趋化因子和细胞外基质降解酶，促进炎症途径，破坏免疫监视，重建细胞外基质，形成肿瘤生态，促进肿瘤细胞的生长和转移。FAP-α是CAF的重要表面标志物，属于脯氨酸特异性丝氨酸蛋白酶家族[1]。其在90%以上恶性上皮性肿瘤中高表达，但在多数正常组织中并不表现出FAP-α活性[2-4]。由于FAP-α特殊的蛋白质结构和生物学功能，被广泛用作肿瘤检测和预后评估的重要标志物[7]。本实验拟结合TCGA数据库检测FAP-α在结直肠癌组织中的表达，并通过临床标本进行验证，探究FAP-α与临床病理特征的相关性及预后价值。

本实验结果显示，FAP-α表达与淋巴结转移和脉管转移有关。这与既往研究相似，多项研究均证实FAP-α可能是肿瘤发生血管生成和淋巴结转移的重要调控因子，如食管鳞状细胞癌、肾细胞癌、胃癌等[3,8]。最近研究结果表明，FAP-α同时具有外肽酶和内肽酶活性，可以在细胞表面发挥蛋白水解酶活性，通过降解细胞外基质，促进肿瘤生长、浸润转移、淋巴管及血管生成，并且与FAP-α高表达细胞共培养，还可促进其他细胞类型(包括肿瘤、内皮细胞和免疫细胞)的增殖、活化和侵袭[9]。目前，FAP-α促进淋巴结转移的机制尚未明确。淋巴结转移主要取决于淋巴管的生成，通过肿瘤细胞浸润到肿瘤内的淋巴管，然后到达附近的淋巴结。因此，淋巴管密度可能是淋巴结转移和癌症进展的敏感指标。Cheng等[10]的实验结果证明，食管鳞癌中的CAF密度与肿瘤淋巴管密度的增加显著相关。此外，血管生成也是肿瘤转移的必不可少病理过程，微血管密度作为血管生成的定量指标被认为是评估血管生成活性的重要指标。Chen等[11]的实验结果证实肺鳞状上皮癌中FAP-α的表达与微血管密度和淋巴管密度之间均呈正相关。Cao等[12]的实验结果亦证实FAP-α可以通过Akt和ERK信号通路促进结直肠癌的血管生成。作为对血管生成中起重要作用的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，已经被证实与肿瘤淋巴管生成和淋巴结转移有关[13]。由于FAP-α可以释放VEGF刺激血管网络的形成，因此FAP-α可能通过相同的机制诱导肿瘤的血管生成和淋巴管生成。

本实验结果显示，FAP-α表达与患者年龄、性别、BMI、ECOG评分、原发灶部位、浸润深度、肿瘤直径、分化程度、神经侵犯、病理分型、RAS基因突变、手术时间均无关；与术后生存期呈负相关。这与TCGA数据库所获取的预后分析结果相同，既往研究亦显示多种肿瘤类型中FAP-α的表达具有预后价值，并且FAP-α本身可促进各种细胞类型的促肿瘤的增殖和转移等功能[1]。Chen等[14]的研究结果显示，在人结直肠癌样本中，FAP-α高表达的CAF通过上调CCL2分泌、招募髓系细胞、降低T细胞活性，促进结直肠癌肿瘤免疫微环境中的免疫抑制，FAP-α高表达预示结直肠癌患者较低的生存期。此外，在其他肿瘤中亦证实，如胃癌中FAP-α高表达的病例亦显示丰富的基因途径，用于免疫调节、血管生成、细胞迁移以及细胞分化和生长，与胃癌分级、淋巴结和腹膜浸润及OS差相关[15-16]。FAP-α在肿瘤组织中的过表达与不良OS和肿瘤淋巴结转移之间的关系更紧密，尤其在结直肠癌或胰腺癌中更为显著。FAP-α通过调节T细胞和肿瘤相关巨噬细胞抑制肿瘤免疫，进而在调节抗肿瘤免疫反应中起关键作用[17]，并且在适当的背景和检测方法下FAP-α可以作为各种人类肿瘤类型中有价值的预后标志物。

综上，本实验结果显示，结直肠癌组织中FAP-α表达上调，且与淋巴结转移和脉管侵犯有关，对于结直肠癌预后有一定的参考价值。