结肠癌中ASPM对细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

安晓静，柏苗苗，谢振年，伍志强，赵 坡

结直肠癌的侵袭和复发是影响预后的主要因素。目前，对于结肠癌的转移和复发仍缺乏长期有效的治疗方法。寻找抑制结肠癌细胞增殖、侵袭和凋亡的靶点对于缓解疾病意义重大。头小畸形相关基因(abnormal spindle-like microcephaly associated, ASPM)是肿瘤干细胞标志物，在多种实体肿瘤中发挥促癌基因作用[1-2]。在前期研究中发现ASPM在结肠癌组织中表达升高，与结肠癌组织中β-catenin的表达呈正相关[3]。但尚未在体外实验中探讨ASPM对结肠癌细胞生物学性能的影响。本文通过体外实验观察ASPM对结肠癌细胞生物学行为的影响及对β-catenin的调节，为结肠癌靶向治疗和改善预后积累研究数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞系 人源结肠癌细胞株SW116、HCT116、HT29、DLD1、SW620和LS180均来自中国人民解放军总医学院第一医学中心生物治疗科。

1.1.2试剂 Trizol试剂、反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒购自Gibco公司；DMEM培养基、胎牛血清、Lipofectamine 2000转染试剂盒购自Invitrogen公司。CCK8试剂盒购自碧云天生物公司；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒购自三箭生物公司；ASPM抗体购自Lifespan公司，β-catenin抗体购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与转染 将细胞复苏后使用含10%FBS的DMEM培养基，在5%CO2、37 ℃细胞培养箱中常规传代培养，选择处于生长对数期的细胞作为研究对象。

细胞转染：选取生长状态较好的结肠癌细胞进行转染。首次转染带有荧光标记的阴性对照组，荧光显微镜下观察细胞转染情况，转染率达80%以上即可。计数细胞密度后接种于6孔板中，按照转染试剂盒说明书进行操作，siRNA-NC转染组为阴性对照(negative control, NC)组。将siRNA-ASPM转染入细胞48 h后，采用qRT-PCR技术检测细胞中ASPM的表达，选取两种沉默效果较好的siRNA序列作为后续实验，设为siRNA1组和siRNA2组。同时设置空白组(未转染的细胞)。LiCl是Wnt信号通路的激活剂，因此挽救实验中设置NC组、siRNA组和siRNA+LiCl组。

1.2.2CCK8法检测细胞增殖 收集转染成功的细胞，接种于96孔板中，重复3孔，每孔加入培养基200 μL，培养箱内常规培养，取对数生长期的SW116和HCT116细胞，以每孔5×103个细胞接种于96孔板中，常规培养。待细胞生长融合达80%时，加入siRNA，每组设立3个复孔，每孔加入10 μL CCK8溶液，于培养箱中孵育4 h，用酶标仪在450 nm波长处测定每孔的光密度(optical density, OD)值。

1.2.3Transwell实验检测细胞侵袭 将小室板上室包被、水化基质胶，于小室板下室中加入550 μL 10%无血清细胞悬液(每毫升细胞5×104个)及siRNA-ASPM，常规培养48 h。取出小室板进行固定染色，中性树胶封固，倒置显微镜下观察并拍照，每张载玻片随机拍摄5个视野，计数并取均值作为1次实验结果，实验重复3次。

1.2.4Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率 将细胞平铺于6孔板中，转染48 h后，吸出培养液，转移至离心管中，洗涤细胞。用不含EDTA的胰酶消化细胞，离心，弃去培养液，收集细胞。参照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明，通过流式细胞仪检测。

1.2.5Western blot法 siRNA转染细胞48 h，提取细胞总蛋白。按照每孔50 μg上样，经SDS-PAGE分离、转膜、封闭、洗膜，添加ASPM和β-catenin一抗稀释液，4 ℃孵育过夜，洗膜，加二抗稀释液，室温孵育1～2 h，加ECL发光液，在暗盒中使用X光胶片曝光，拍照。Quantity One软件进行灰度值分析。以目的蛋白与内参蛋白actin的灰度值比值作为各蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.2.6qRT-PCR 利用Trizol法提取总RNA，紫外分光光度计分析RNA的浓度和纯度，逆转录获取cDNA后，采用qRT-PCR扩增目的基因，以actin为内参分析ASPM和β-catenin的表达，反应条件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，合计40个循环。相对表达量以2-△△Ct表示。

2 结果

2.1 不同结肠癌细胞株中ASPM蛋白表达检测6种不同结肠癌细胞株(HT29、SW116、HCT116、DLD1、SW620和LS180)中ASPM蛋白表达，结果显示SW116和HCT116细胞株中ASPM蛋白表达高于其他细胞株(图1)。

图1 不同结肠癌细胞株中ASPM蛋白表达：

2.2 siRNA-ASPM后转染后，不同处理组中HCT116和SW116细胞内ASPM的表达选取两种ASPM蛋白表达较高的HCT116和SW116结肠癌细胞作为实验对象。HCT116和SW116细胞均设NC组、siRNA-ASPM-2559组、siRNA-ASPM-9315组、siRNA-ASPM-10413组和siRNA-ASPM-10049组。siRNA-ASPM转染48 h后，HCT116细胞中，siRNA-ASPM-2559、siRNA-ASPM-9315、siRNA-ASPM-10413和siRNA-ASPM-10049组中ASPM mRNA相对表达量分别为0.24±0.02、0.12±0.01、0.77±0.02、0.61±0.05(图2)，干扰效果分别为24.4%、11.9%、77.4%和61.1%。SW116细胞中，siRNA-ASPM-2559、siRNA-ASPM-9315、siRNA-ASPM-10413和siRNA-ASPM-10049组中ASPM mRNA相对表达量分别为0.47±0.03、0.22±0.02、0.39±0.04、0.69±0.03(图3)，干扰效果分别为46.9%、22.0%、39.4%和69.1%。结果显示，加入siRNA后，RT-PCR检测显示ASPM mRNA相对表达量空白组(HCT116和SW116均为1±0)与NC组(HCT116为1.16±0.01，SW116为1.10±0.02)中ASPM的表达差异无显著性。故后续实验未再设置空白组。

图2 siRNA-ASPM转染后，不同处理组中HCT116细胞内ASPM的表达变化

图3 siRNA-ASPM转染后，不同处理组中SW116细胞内ASPM的表达变化

2.3 siRNA-ASPM转染后SW116和HCT16细胞的增殖siRNA-ASPM转染后，siRNA组HCT116细胞和SW116细胞与NC组相比，细胞存活率明显下降(P<0.05，图4、5)。

图4 siRNA-ASPM转染后，不同处理组中HCT116细胞的存活率

图5 siRNA-ASPM转染后，不同处理组中的SW116细胞的存活率

2.4 siRNA-ASPM转染后SW116和HCT116细胞的侵袭能力变化siRNA-ASPM转染后，HCT116细胞中，siRNA-ASPM-2559组和siRNA-ASPM-9315组的Transwell小室下层细胞计数较NC组明显减少(P<0.05，表1，图6)。

图6 siRNA-ASPM转染后，不同处理组HCT116细胞的侵袭能力：

在SW116细胞中，siRNA-ASPM-9315组侵袭进入小室下层的细胞数较NC组明显减少(P<0.05)；siRNA-ASPM-10413组进入小室下层的细胞数较NC组减少，但差异无统计学意义(P>0.05)(表1，图7)。

表1 siRNA-ASPM转染后HCT116和SW116细胞的侵袭能力

2.5 siRNA-ASPM转染后HCT116和SW116细胞的凋亡siRNA-ASPM转染后，HCT116细胞中siRNA-ASPM-2559组和siRNA-ASPM-9315组细胞凋亡率与NC组相比，均明显升高(P<0.05，图8)。SW116细胞中，siRNA-ASPM-9315组和siRNA-ASPM-10413组细胞凋亡率分别与NC组相比，凋亡率明显上升，差异有显著性(P<0.05，图9)。

图8 流式细胞术检测沉默ASPM表达后HCT116细胞凋亡率：

图9 流式细胞术检测沉默ASPM表达后SW116细胞凋亡率：

2.6 siRNA-ASPM转染后，HCT116细胞中ASPM和β-catenin的表达siRNA-ASPM转染后，siRNA组HCT116细胞中ASPM和β-catenin水平与NC组相比，显著降低(P<0.05，图10)。

图10 转染siRNA-ASPM后，HCT116细胞中ASPM和β-catenin mRNA和蛋白的表达：

2.7 Wnt信号通路激活剂LiCl对β-catenin表达的影响qRT-PCR和Western bolt实验结果证实，与siRNA-ASPM-2559组相比，siRNA-ASPM-2559+LiCl组能够增加β-catenin mRNA的升高(P<0.05)；β-catenin蛋白表达水平亦有所增加，但差异无统计学意义(P>0.05，图11)。

图11 挽救实验检测加入LiCl后对β-catenin的表达的影响：

2.8 siRNA-ASPM转染后，HCT116细胞质和细胞核中β-catenin蛋白表达为进一步观察ASPM对β-catenin表达的影响，实验选择了沉默效果较好的siRNA-ASPM-2559探针进行转染，进行核质分离实验。转染后，siRNA组HCT116细胞质和细胞核中β-catenin水平与NC组相比，均明显降低(P<0.05，图12)。

图12 转染siRNA-ASPM后，HCT116细胞质和细胞核中β-catenin蛋白表达：

3 讨论

ASPM是果蝇有丝分裂纺锤体蛋白的人类同源基因[4]。ASPM编码的蛋白是一种纺锤体极/中间体蛋白，其作用在于调节细胞有丝分裂的方向和胞质的分离[5]。在胰腺癌细胞中，将ASPM基因敲除，胰腺癌细胞的增殖和迁移能力均明显下降[2]。在前列腺癌的研究中同样发现，敲除ASPM后，前列腺癌细胞的增殖速度减慢，减少了处于S期的癌细胞的比例；同时，前列腺癌细胞的成球能力和侵袭能力亦下降明显[6]。

本组实验检测了6株结肠癌细胞系(HT29、SW116、HCT116、DLD1、SW620和LS180)中ASPM的蛋白表达，结果显示6株结肠癌细胞中ASPM蛋白表达不同，其中SW116和HCT116细胞中ASPM的蛋白表达最高。选择ASPM蛋白含量较高的结肠癌细胞，进行siRNA转染，48 h后，结肠癌细胞增殖和侵袭能力均明显降低，但凋亡率升高，提示沉默ASPM基因可引发结肠癌细胞恶性生物学能力降低。

Wnt/β-catenin信号通路是胚胎发育过程中最重要的分子调节机制，同时在成熟组织中也调节了细胞的再生和平衡发展。多数结直肠癌中，均存在着由于细胞内的某些成分突变导致Wnt信号通路过度激活的现象。大部分结肠癌发生的核心步骤是Wnt信号通路中β-catenin在细胞质内无法降解，入核内聚集引发下游效应因子[7]。在胰腺癌PANC-1和AsPC-1细胞株中检测发现，沉默ASPM后导致β-catenin蛋白水平持续降低[2]。但在前列腺癌的研究中发现ASPM是通过直接调节DVL3蛋白的稳定性间接影响了β-catenin的稳定性，免疫共沉淀实验证实ASPM与DVL3具有相关性，而与β-catenin并无直接的相关性[6]。

本实验结果显示，干扰结肠癌细胞中ASPM的表达，细胞中β-catenin mRNA和蛋白的表达均降低。进一步行核质分离实验后发现细胞质和细胞核内β-catenin的表达均显著下降。挽救实验中加入Wnt信号通路激活剂LiCl后，β-catenin mRNA的表达有所回升。蛋白表达虽有所回升，但差异无显著性。由此推测ASPM可能通过调节β-catenin激活Wnt信号通路发挥作用，且对β-catenin在胞质中的聚集即开始发挥影响。但ASPM是直接影响了β-catenin的表达，还是作用于其上游调节因子间接影响了β-catenin的表达有待于进一步证实。在挽救实验中，β-catenin mRNA水平有所恢复，但差异无显著性，推测可能存在其他分子机制影响了转录后调控，是后续研究值得探索的现象。

综上所述，ASPM维持了结肠癌细胞的恶性生物学行为。将ASPM沉默后结肠癌细胞HCT116增殖活性降低，细胞侵袭力下降，凋亡率升高，可能与ASPM引起β-catenin的异常表达有关，本实验初步分析了ASPM对结肠癌表观指标的影响，具体机制有待深入探讨。