基于网络药理学和细胞分子生物学探讨鸡血藤治疗宫颈癌的作用机制

田崇梅 赵亚萍 傅利萍

浙江中医药大学附属绍兴中医院 浙江，绍兴 312000

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，主要病因为高危型人类乳头状瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持续感染，常见鳞癌、腺癌和腺鳞癌三种类型，可发生直接蔓延或淋巴转移[1]。目前临床上的治疗方式主要为手术治疗和放化疗，但副作用很大，常引起恶心、呕吐、腹泻等不良反应[2]。因此，探究宫颈癌发病机制，开发治疗宫颈癌的天然新药，具有非常重要的临床意义。

鸡血藤是我国的传统中药，来源于豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn）的干燥藤茎。中国药典（2020年版）记载，鸡血藤具有活血、补血、调经、舒筋活络等功效，可用于妇科疾病中的月经不调、痛经、血虚萎黄等症。此外，鸡血藤具有抗癌作用，能够诱导直肠癌细胞凋亡，诱发氧化应激反应[3]，但鸡血藤对宫颈癌的作用鲜有报道。本研究运用网络药理学方法，通过筛选鸡血藤的有效成分，拟阐明鸡血藤抗宫颈癌的作用机制，并通过细胞分子生物学实验进行验证，为其临床应用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 数据库与软件 （1）中药药理学系统分析平台（Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform，TCMSP）数据库：http://tcmspw.com/tcmsp.php；（2）基因组注释数据平台 （genome annotation database platform，GeneCard）：http://www.genecards.org/；（3）UniProt数据库：https://www.uniprot.org/；（4）Venny工具：http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/；（5）String数据库：https://string-db.org/；（6） 生物学信息注释数据库（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）：https://david.ncifcrf.gov/；（7）京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 数据库：https://www.kegg.jp/；（8）R语言绘图工具。

1.2 细胞株 宫颈癌Hela细胞株购于上海中科院细胞库（ATCC:28365），培养于含10%胎牛血清的洛斯维·帕克纪念研究所（Roswell Park Memorial Institute 1640，RPMI 1640）培养基中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。

1.3 药品和试剂 鸡血藤饮片购于浙江中医药大学中药饮片厂（批号：191201）；胎牛血清购于美国Gibco公司 （批号：10270106）；RPMI 1640培养基购于Hyclone公司（批号：AB216694）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT] 试剂购于美国Sigma公司（批号：1755C459）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒均购于康为世纪公司（批号：50206、00271508）；胱天蛋白酶3（caspase 3，CASP3）、Bax、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Vimentin、E-cadherin和β-actin抗体均购于美国Cell Signaling Technology公司 （批号：0001、0013、0031、0002、0011、0015）； 荧光二抗IRDye 800 CM Goat anti-Rabbit抗体和IRDye 680 CM Goat anti-Rabbit抗体均购于美国LI-COR公司（批号：C70426-05、C70124-05）。

1.4 主要仪器 KQ-500DE型超声仪购于昆山市超声仪器有限公司；CP153型电子天平为奥豪斯仪器（上海）有限公司产品；FD-1C-80型冷冻干燥机购于北京博医康实验仪器有限公司；5427R型高速冷冻离心机购于德国Eppendorf公司；CO2培养箱和超净台均为美国赛默飞世尔科技公司产品；Synergy H1MFD型多功能酶标仪购于美国Biotek公司；LI-COR Odyssey型双色红外荧光成像系统购于美国LI-COR公司。

1.5 网络药理学实验方法

1.5.1 鸡血藤成分预测与筛选 以“鸡血藤”作为关键词，在TCMSP数据库中以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且 类药 性 （drug-likeness，DL）≥0.18为条件，筛选鸡血藤的有效活性成分。

1.5.2 关键靶点收集 通过Drugbank数据库筛选鸡血藤中有效成分的相关靶点，并通过UniProt数据库进行整理归纳；通过GeneCards数据库输入“cervical cancer”（宫颈癌），选择人类基因，得到其相关靶点，通过Venny工具将二者取交集，得到交集靶点。

1.5.3 关键靶点蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建及筛选 通过String数据库对鸡血藤有效成分与宫颈癌交集关键靶点构建PPI网络，选择物种为人类。筛选平均度值 （degree）≥50的节点，作为鸡血藤治疗宫颈癌的关键蛋白节点。

1.5.4 基因本体（gene ontology，GO）分析 将鸡血藤有效成分与宫颈癌交集靶点导入DAVID数据库，选择物种为人类，进行GO分析。最终设定阈值P＜0.05，筛选出具有显著性差异的生物过程，用GraphPad Prism 5绘图。

1.5.5 KEGG分析 通过KEGG数据库，搜索KEGG mapping中的Search Pathway，输入鸡血藤有效成分与宫颈癌交集靶点，得到鸡血藤治疗宫颈癌的信号通路图。

1.6 细胞分子生物学实验方法

1.6.1 细胞增殖率检测 宫颈癌Hela细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，以MTT法检测不同浓度鸡血藤醇提物对宫颈癌Hela细胞增殖率的影响。鸡血藤醇提物提取条件：药材粉碎后过4号筛，以80%乙醇，料液比1∶20，功率300W，频率60kHz，超声提取25min，旋转蒸发并冷冻干燥，获得冻干粉。

1.6.2 凋亡相关蛋白表达水平检测 取对数生长期宫颈癌Hela细胞，接种于6孔板中，培养24 h后收集各组细胞，提取细胞中总蛋白，通过BCA法测定蛋白浓度，通过电泳分离，将蛋白转移至活化的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，随后将膜封闭于5%脱脂奶粉中，一抗4℃孵育过夜，洗膜3次，每次10min，二抗避光孵育2h，最后显色，通过Image J 1.41软件计算各蛋白的相对表达量。

1.7 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件及Graph-Pad Prism 7.0绘图软件进行统计学分析，每次实验重复3次。计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用最小显著法检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鸡血藤有效成分的预测 通过在TCMSP数据库中检索，以OB≥30%且DL≥0.18为条件，并删除靶点≤1的成分，共得到21种化学成分。见表1。

表1 鸡血藤潜在有效成分Tab.1 Potential effective ingredients of Spatholobi Caulis

2.2 作用靶点预测 通过TCMSP数据库和Drugbank数据库收集到鸡血藤有效成分相关靶点110个，通过GeneCards数据库分析得到宫颈癌靶点6 662个，通过韦恩图分析共有100个交互靶点，即得到鸡血藤治疗宫颈癌的关键靶点。见图1。

图1 鸡血藤与宫颈癌靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of Spatholobi Caulis and cervical cancer targets

2.3 PPI网络构建 将鸡血藤有效成分治疗宫颈癌的100个关键靶点制成PPI网络图。见图2。去掉游离靶点，共涉及97个节点及1 205条边，平均degree为24.34。这97个靶点相互作用、相互影响，通过多通道、多方面、多维度协调的机制治疗宫颈癌。

图2 鸡血藤治疗宫颈癌靶点的相互作用网络Fig.2 Interaction network of protein targets of Spatholobi Caulis in the treatment of cervical cancer

如图3所示，根据连线多少进行整合分析，得到前30名连线较靠前的靶点，根据degree≥50条件得出前9个关键蛋白节点，关键蛋白分别为蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、原癌基因JUN和MYC、CASP3、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、 白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、信号传导与转录激活因子3 （signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），这说明以上靶点基因对于鸡血藤治疗宫颈癌具有非常重要的意义，可作为鸡血藤有效成分的作用靶点。

图3 鸡血藤治疗宫颈癌的关键蛋白Fig.3 Key protein of Spatholobi Caulis in the treatment of cervical cancer

2.4 GO富集分析 细胞生物过程富集基因数越多，颜色越红，表明错误检出率（false discovery rate，FDR）越低，相关性越强。GO富集分析结果显示，鸡血藤100个潜在靶点基因中GO分析结果排名较靠前的生物学功能如下：蛋白体的活动、近端启动子序列特异性脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）结合、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）聚合酶Ⅱ特异性、辅因子结合、血红素结合、泛素样蛋白结合、核受体活性等。见图4。由此表明，鸡血藤能够通过参与多种生物学过程抗癌。

图4 鸡血藤治疗宫颈癌靶点的GO分析Fig.4 GO analysis of Spatholobi Caulis in the treatment of cervical cancer

2.5 KEGG通路富集分析 结果提示，靶点主要涉及的通路为动脉粥样硬化晚期糖基化终末化产物（advanced glycation end products，AGE）及晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、乙肝、人巨细胞病毒感染、肿瘤坏死因子和细胞凋亡信号通路等，提示以上通路可能成为深入研究鸡血藤抗宫颈癌的重要靶点，且与前列腺癌、直肠癌、胰腺癌、膀胱癌、肝癌等肿瘤关系密切。见图5。由此表明，多成分、多靶点、多通路相互调节可能是鸡血藤抗宫颈癌的作用机制。

图5 鸡血藤治疗宫颈癌靶点的KEGG通路分析Fig.5 KEGG pathways analysis of potential targets of Spatholobi Caulis in the treatment of cervical cancer

2.6 靶点途径分析 涉及凋亡的相关基因为CASP3、CASP8、CASP9、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）、Bcl-2、氨基末端转移酶（N-terminal kinase，JNK）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），这些基因在图中标记为红色。 见图6。说明鸡血藤抗宫颈癌与细胞凋亡密切相关，该结果能够为进一步细胞分子生物学验证分析提供参考。

图6 鸡血藤治疗宫颈癌靶点相关通路Fig.6 Related pathways of Spatholobi Caulis in the treatment of cervical cancer

2.7 细胞分子生物学实验

2.7.1 鸡血藤醇提物对宫颈癌Hela细胞增殖抑制

MTT结果提示，鸡血藤醇提物具有抑制宫颈癌Hela细胞增殖的作用，伴随着浓度的增加，增殖抑制率也显著增加（P＜0.05，P＜0.01），半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）=62μg·mL-1，提示鸡血藤醇提物可抑制宫颈癌Hela细胞的增殖。见图7。

图7 鸡血藤醇提物对宫颈癌Hela细胞增殖抑制的影响Fig.7 Inhibitory effects of ethanolic extract of Spatholobi Caulis on proliferation of Hela cells

2.7.2 鸡血藤对凋亡相关蛋白表达的影响 CASP3、Bcl-2和Bax是细胞凋亡的关键因子[4]，鸡血藤醇提物处理后宫颈癌Hela细胞CASP3和Bax蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达明显降低。见图8。Bcl-2蛋白能够抑制细胞凋亡，而CASP3和Bax蛋白则促进细胞凋亡，由此可以看出鸡血藤醇提物对宫颈癌Hela细胞凋亡具有促进作用。Vimentin和E-cadherin蛋白是与细胞迁移相关的因子，Vimentin能够促进细胞迁移，而E-cadherin则抑制细胞迁移[5]。本研究结果表明，鸡血藤醇提物处理后Vimentin蛋白表达明显降低，而E-cadherin的表达明显升高。见图8。因此，鸡血藤醇提物通过提高宫颈癌Hela细胞凋亡相关蛋白的表达，抑制迁移蛋白的激活，从而诱导宫颈癌Hela细胞凋亡，发挥抗癌作用。

图8 鸡血藤醇提物对宫颈癌Hela细胞凋亡蛋白表达的影响Fig.8 Effect of ethanolic extract of Spatholobi Caulis on apoptosis protein expression of Hela cells

3 讨论

《本草备要》记载鸡血藤具有活血补血、调经止痛、舒筋活络的功效，用于月经不调、痛经、经闭、风湿痹痛、麻木瘫痪、血虚萎黄的治疗。研究证实，鸡血藤能够通过多种药理机制抑制癌症，包括抑制炎症、抗氧化应激、促进细胞凋亡、促进自噬、抗肿瘤转移等[6]。网络药理学是一门重要的新兴学科，能够筛选中药中的活性成分以及潜在靶点，这恰好与中国传统中药多成分、多靶点、多通路协同发挥作用的特性相符[7]。本研究基于网络药理学，通过数据库筛选鸡血藤抗宫颈癌的有效成分、关键靶点和作用通路，并通过细胞分子生物学实验验证鸡血藤对宫颈癌Hela细胞凋亡及侵袭转移相关蛋白表达的影响，阐明鸡血藤抗宫颈癌的可能作用机制。

本研究首先通过TCMSP数据库筛选出鸡血藤中21种活性成分，这可能成为鸡血藤抗宫颈癌的物质基础。有研究报道，鸡血藤中的甘草查尔酮A（licochalcone A）和木犀草素（luteolin）对人肺癌A549细胞具有显著的抑制作用，能够通过凋亡通路治疗非小细胞肺癌[8]，这提示鸡血藤抗宫颈癌可能与调节凋亡通路有关。本研究通过PPI网络筛选出9个与细胞凋亡密切相关的关键作用靶点，分别为AKT1、MAPK1、EGFR、JUN、MYC、CASP3、VEGFA、IL-6、STAT3。在细胞凋亡中CASP家族扮演着非常重要的角色，相关基因有CASP3、CASP8、CASP9、Bcl-2等，其中Bcl-2作为自噬反应代表蛋白，参与许多疾病的发生发展过程[9-10]。为了深入研究鸡血藤抗宫颈癌的分子机制是否与细胞凋亡有关，课题组进一步以体外实验加以验证。免疫印迹结果表明，鸡血藤能够调控宫颈癌Hela细胞中凋亡相关基因CASP3、Bcl-2和Bax，迁移相关基因Vimentin和E-cadherin的蛋白表达，诱导癌细胞凋亡，并抑制其迁移，由此表明鸡血藤抗宫颈癌的作用机制与细胞凋亡密切相关，为进一步研究提供了新靶点。

综上所述，本研究采用网络药理学方法研究鸡血藤抗宫颈癌的作用机制，阐明鸡血藤治疗宫颈癌是通过多成分、多靶点和多通路发挥作用，并通过细胞分子生物学实验证实鸡血藤能够诱导宫颈癌细胞凋亡。本研究结果为深入研究鸡血藤抗宫颈癌提供了实验基础，并为开发高效低毒的天然抗癌新药提供了新思路。