胞内分枝杆菌感染对小鼠肺CD3+CD4+、CD3+CD8+T 细胞表达的影响

张丽娇 雷敏 刘宁 侯冰 郭铜 薛思明

（长春师范大学生命科学学院 130032）

在人类中，非结核分枝杆菌（NTM）是一个重要的临床问题，与显著的发病率有关，其发生率在全世界范围内都在增加[1]。CD4+T 细胞的免疫作用在分枝杆菌感染中起至关重要的作用。结核分枝杆菌感染巨噬细胞，MHC 分子负责将菌体抗原递呈，CD4+T 细胞接收信息，相关的细胞因子IFN-γ、TNF-α 大量分泌[2-4]。而有研究表明，CD8+T 细胞在被菌体感染后也会出现IFN-γ 等细胞因子，CD8+T 细胞的免疫作用在菌体感染中也不容忽视[5-7]。有必要进一步研究CD4+、CD8+T 细胞在NTM 感染过程中的功能。本实验从牛颌下腺淋巴结中分离出一种胞内分枝杆菌，旨在比较胞内分枝杆菌与BCG 菌株的感染特性和宿主免疫机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂

C57BL/6 小鼠，雌性，4 周龄，北京华阜康生物科技股份有限公司；TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-12 的ELISA 检测试剂盒，R&D 公司；BCG 菌株、胞内分枝杆菌，由吉林农业大学免疫与微生物实验室提供；胶原酶XI，Sigma 公司；7H9 培养基、CD3 抗体 (Rat Anti-Mouse)、CD4 抗体 (Rat Anti-Mouse)、CD8 抗体(Rat Anti-Mouse)、BD 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胞内分枝杆菌在小鼠肺内的增殖

用对照菌株BCG 和分离的胞内分枝杆菌腹腔感染小鼠（1×106菌体/小鼠）。感染过程设15、30、45 和60d 4 个检测时间段，并设空白对照组。每个时间点共有5 只动物受到感染。通过用稀释的肺脏匀浆在7H9 培养基上检测细菌增殖率。

1.2.2 流式细胞术检测小鼠肺CD3+CD4+、CD3+CD8+T 细胞的变化

肺组织用胶原酶XI 消化，得到肺单细胞悬液[8-9]。细胞（1×105/管）在4℃条件下用分别用CD3 抗体、CD4 抗体、CD8 抗体单克隆抗体孵育20min[10]。流式细胞术分别检测染菌后15、30、45 和60d CD3+CD4+、CD3+CD8+T 细胞比例。

1.2.3 Elisa 法检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-10 的表达

收集小鼠血清并在-80℃冷冻，用Elisa 试剂盒检测IFNγ、TNF-α、IL-12、IL-10 的表达。

1.3 统计学处理

Graphpad Prism 5.0 软件作图并分析数据。C6 流式软件制作流式图，用T 检验比较组间差异。＜0.05 表示有差异，用*表示；＜0.01 表示差异显著，用**表示，＜0.001 表示差异极显著，用***表示。

2 结果

2.1 胞内分枝杆菌在小鼠肺内的增殖

感染胞内分枝杆菌和BCG 菌株导致15d 时肺部严重感染（见图1），但细菌数量逐渐减少，到60d 时基本清除（见图2）。感染胞内分枝杆菌组的细菌数量大于BCG 菌株组（＜0.01）（见图2）。

图1 小鼠感染菌体15d 后肺组织抗酸染色切片（×200）

2.2 流式细胞术检测小鼠肺CD3+CD4+、CD3+CD8+ T细胞的变化

在感染胞内分枝杆菌的小鼠中，CD3+CD4+T 细胞大量涌入，与其他组相比，30d 的数量达到最高水平（＜0.010），然后下降（图3）。但BCG 感染组CD3+CD4+T 细胞并没有迅速减少（图3）。胞内分枝杆菌组在45、60d 时CD3+CD8+T 细胞的数量最多，与其他组相比（＜0.010）（图4）。这些结果与15d 时组织病理学分析相一致，我们观察到更多的胞内分枝杆菌感染小鼠的淋巴细胞损伤。

图3 胞内分枝杆菌感染对小鼠肺CD3+CD4+T 细胞表达的影响

图4 胞内分枝杆菌感染对小鼠肺CD3+CD8+T 细胞表达的影响

2.3 Elisa 法检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-10 的表达

在感染小鼠的血清中，IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-10 的表达表明从感染第15 天开始，感染胞内分枝杆菌小鼠的血清中含有更多的IFN-γ。30d 胞内分枝杆菌的IFN-γ 水平高于其他组（＜0.001），45、60d 时IFN-γ 表达下降明显。进一步分析显示，TNF-α 和IL-12 的表达结果与IFN-γ 相似。此外，感染胞内分枝杆菌的小鼠中IL-10 高于BCG 组和空白对照组，特别是在30d 后IL-10 表达下降不明显（＜0.001）（如图5）。

图5 胞内分枝杆菌感染对小鼠IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-10 表达的影响

3 讨论

在过去的几十年里，研究者已经阐明对NTM 感染所激活的宿主免疫机制，但研究成果有限[11,12]。还需要进一步研究来调查NTM 的流行病学、临床表现和宿主免疫机制，特别是CD4+T、CD8+T 细胞相关的免疫机制，CD4+T 细胞在感染过程中主要对机体进行免疫保护，并分泌保护细胞因子，而CD8+T 细胞在感染过程中主要起毒性杀伤及抑制作用。

通过菌体增殖实验证实，胞内分枝杆菌与BCG 相比在肺部生长得更快，特别是15d 时数量较多，抗酸染色也观察到感染小鼠肺内菌体。但数量不断减少，在感染60d 时数量已经非常少。这可能与机体免疫机制及菌体毒力相关，有些菌体被排出体外，有些菌体存活下来，对机体造成损伤。

该项研究调查了宿主对胞内分枝杆菌感染的CD4+T、CD8+T 细胞相关的免疫机制。结果表明，在15d 后，肺部感染因胞内分枝杆菌诱导的CD4+T 细胞保护反应而减慢，并有高水平的TNF-α、IL-12 和IFN-γ 产生。但在30d 后，CD4+T反应随着CD8+T 细胞反应的大量出现而下降。一些免疫抑制性细胞因子，如IL-10，随着感染时间的延长表达量并没有下降，IL-10 先前已被证实，在分枝杆菌感染期间对TNF-α 和IFN-γ 的产生有副作用[13]；因此，我们观察到从第30 天开始，TNF-α 和IFN-γ 的诱导率较低，这可能与高水平的IL-10 产物出现有关。而BCG 组在感染全过程都以CD4+T 细胞反应为主，同时抑制CD8+T 细胞反应，并且相应细胞因子的表达也是这个趋势。说明在不同菌体感染机体过程中，CD4+T 细胞及CD8+T 细胞相应的免疫作用也不同，这也能与菌体毒力等因素有关。这些研究有助于提高我们对NTM 的深入理解，为治疗NTM 感染提供坚实的实验室基础。