生猪养殖中非洲猪瘟病毒分子流行病学监测与分析

顾丛丛

（山东省桓台县畜牧渔业服务中心 256400）

1 材料

1.1 采样用品

磷酸盐缓冲保护液（含有30%甘油和10%双抗）、一次性使用灭菌棉拭子、75%酒精、1.5ml EP 管、EDTAk2 无菌抗凝管、记号笔、冰袋、封口袋、剪刀、记号笔、防护服、口罩、防护帽、手套等。

1.2 主要试剂和仪器

病毒DNA/RNA 提取试剂盒（4.0），西安天龙科技有限公司生产。非洲猪瘟病毒荧光PCR 检测试剂盒，本试剂盒采用Taqman 探针实时荧光聚合酶链式反应（Real time PCR），对非洲猪瘟病毒核酸进行定性或定量检测，深圳真瑞生物科技有限公司生产。全自动核酸提取仪是西安天龙科技有限公司生产的NP968 -C，荧 光 定 量 PCR 仪 器 是 Applied Biosystems QuantStudio 3，生物安全柜是Thermo Fisher Scientific Model 1389。

2 采样

2.1 采样依据

本次采样主要根据《2020 年淄博市非洲猪瘟监测实施方案》 《关于加强病死猪无害化处理环节非洲猪瘟风险管控的通知》 《2020 年桓台县县级动物疫病监测方案》 等。

2.2 样品要求

固体环境样品应放置在加有PH7.2 PBS 的1.5ml EP 管中，液体样品直接放在1.5ml EP 管中，不得少于1ml/管。每头猪的样品应单独包装、编号，同一场点的样品应再加外包装，防止渗漏，样品运输过程中应尽量保持低温。

每家养猪场户采集两栏猪舍的样品，包括猪粪：四角及中心位置每栏采集5 份拭子，放入1 个采样管中；污水：每栏采集1 份，不低于1ml/份；眼鼻拭子、肛门拭子：每栏采集2 头猪的拭子，同一头猪的眼鼻拭子、肛门拭子放入同一个EP 管中。病死猪的样品采集肛门拭子放入EP 管中，抗凝血样品主要采集了两家养殖场，每家养猪场户采集30 份抗凝血，每头猪不少于5ml/管。

2.3 样品采集

本次样品采集针对县域内的生猪养殖场户，从2020 年1～12 月，连续监测12 个月。重点采集了病死猪样品，特别是出现发烧、咳嗽、扎堆、腹泻、呼吸困难、关节肿胀、皮肤溃烂、耳朵发绀等症状、经治疗无效的死亡猪的肛门拭子样品，其次，每月采集7 家年出栏量在2000 头以下生猪养殖场户的样品，包括猪粪、污水、眼鼻拭子、肛门拭子、EDTAk2 抗凝血样品，共采集样品约450 余份。

2.4 样品处理

检测前样品应在二级生物安全柜中处理。棉拭子样品加入1mL 的0.01mol/L PBS (pH7.2)，取出棉拭子，13000rpm 离心10min，保留上清备用；污水样品10000rpm 离心10min，保留上清备用；猪粪样品于EP 管中加入1ml 灭菌生理盐水，混匀，10000rpm 离心10min，保留上清备用。抗凝血样品取1ml 放入EP 管中，10000rpm 离心10min，保留上清备用。将上述处理的样品置于60℃条件下灭活30min。

2.5 样品保存

采集或处理好的样品在2～8℃条件下保存应不超过24h；如需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融(冻融不超过3 次)。

3 检测步骤

3.1 核酸提取

3.1.1 预封装试剂准备

从试剂盒中取出真空包装的预封装试剂，颠倒混匀数次使磁珠重悬，去掉真空包装，轻甩孔板，使试剂及磁珠均集中到孔板底部，使用前小心撕去铝箔封口膜，避免振动，防止液体溅出。

在预封装试剂的第1 或7 列中分别加入20μl 蛋白酶K 溶液，200μl 样本，阴阳性对照无需进行核酸提取处理，可直接用于荧光PCR 检测。

NP968 系列核酸提取仪按以下程序进行自动化提取。

（1）移磁，混合时间1min，磁吸时间10s，温度0℃。

（2）裂解，混合时间5min，磁吸时间45s，90℃裂解加热。

（3）洗涤1，混合时间2min，磁吸时间30s，90℃洗脱加热。

（4）洗涤2，混合时间1min，磁吸时间20s，90℃洗脱加热。

（5）洗涤3，混合时间1min，磁吸时间20s，90℃洗脱加热。

（6）洗脱，混合时间5min，磁吸时间35s，90℃洗脱加热。

（7）弃磁，混合时间1min，磁吸时间0s，温度0℃。

自动化程序结束后，将第6 或12 列的洗脱液转移至干净的无核酸酶离心管中。

3.1.2 试剂配制

取ASFV 核酸荧光PCR 检测混合液（n×22.5μl）与Taq 酶（n×0.4μl）混合，震荡混匀数秒，3000rpm 离心数秒。

3.1.3 加样

取上数混合液22.5μl 于PCR 反应管中，然后将阴性对照品、已处理样品、阳性对照品各2.5μl 分别加入PCR 反应管中，盖好PCR 反应管盖，立即进行PCR 扩增反应。

3.1.4 PCR 扩增

反应管置于定量荧光PCR 仪上，采用常规模式，94℃，2min，循环数1；93℃，15s，60℃，60s，循环数40。单点荧光检测在60℃，荧光通道检测选择：FAM，passive reference 和quencher 处选择none。

3.1.5 基线和阈值设定

基线调整取6～15 个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品的最高点。

3.1.6 结果成立条件

阳性对照品：CT 值≤35。阴性对照品：未检出。以上需求需要同时满足，否则本次试验无效，需要重新进行，参见附表。

附表 CT值评价标准表

4 结果

每月检测一次，对450 余份样品检测结果均为阴性，未检出ASFV 核酸。监测曲线，见附图。

附图 ASFV核酸监测曲线图

5 讨论

经过为期12 个月的监测，全县养殖场户的环境样品，如猪粪、污水非洲猪瘟监测均为阴性，肛门、眼鼻拭子也均为阴性，该结果与恒台县有效防控非洲猪瘟的工作落实有关。这些工作措施如下。

（1）宣传教育到位。县防控指挥部利用专题会、明白纸、宣传画、广播电视、微信平台等，广泛宣传非洲猪瘟的防控知识，消除养殖场户的恐慌心理，增强防控信心，推动非洲猪瘟防控工作开展。

（2）疫情排查到位。非洲猪瘟防控工作抓早抓小是关键，做到早发现、早诊断、早处置，全县八个乡镇配备20 余名专业技术人员，33 名村级动物防疫员按照各自的防疫责任区域，每天1 排查、2 报告，做到排查不漏户（场）、排查有签字、现场有记录。

（3）全程监管到位。各项防控措施安排及时得当、乡镇疫情排查上报及时、基层畜牧兽医防控技术宣传指导到位、动物卫生检疫检测到位、公路检查站、生猪产品市场监管到位。

（4）检疫检验到位，县动物疫病预防与控制中心投资一百余万元，扩建了分子生物学实验室，为全县非洲猪瘟的监测提供了强有力的技术保障。此外，有效的宣传使恒台县部分生猪规模养殖场对疾病认识非常到位，自我提高生物安全办厂要求，自费购买荧光PCR 仪等设备，对生猪、猪舍污染物、饲料、养殖环境等进行日常监测，投入的同时也带来了巨大的经济效益。

（5）物质保障到位。物质经费保障是做好非洲猪瘟防控工作的重要保障，村防疫人员的薪资全部纳入财政支付，全县各项应急物资储备，生活设施、车辆运行、生活补助，督查人员的车辆运行，防控指挥部印发各项防控资料、宣传材料、防控明白纸，应急无害化处置补助等经费支出，虽然数量很大，均能及时拨付。

生猪养殖过程中非洲猪瘟的防控工作不是一个单独部门或养殖环节的工作，需要养殖过程中的各部门及饲养环节相互联合，做好联防联控工作才能做好非洲猪瘟防控工作。