基于网络药理学和分子对接探讨紫草治疗胃癌的作用机制

张飞，赵琦，刘杰民游绍伟黄敬

（1.贵州中医药大学，贵州贵阳550025；2.贵州中医药大学第二附属医院，贵州贵阳550003；3.贵州省人民医院，贵州贵阳550002）

胃癌（gastric cancer）作为全球第五大最常见的癌症，目前该病的治疗方法取得了可观的进步，但是其仍然是我国以及全世界发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一[1,2]。由于胃癌的早期发病较隐匿，大多数患者诊断出已是中晚期，往往错过了最佳的治疗时机。胃癌的主要治疗方法为手术治疗和化学靶向疗法，但是其导致的术后复发率高和易出现耐药性对该病的治疗增添了难度，因此急需寻找出能够辅助治疗胃癌且副作用低的药物。有研究表明，中药的有效成分可通过多途径、多机制抑制肿瘤生长和逆转由化疗引起的耐药现象，其具有疗效确切、副作用少和整体调节等优点，在治疗恶性肿瘤方面具有积极的前景[3,4]。

紫草（Radix Arnebiae）为紫草科植物新疆紫草（Arnebia euchroma Johnst）或内蒙紫草（Arnebia guttata Bunge）的干燥根，具有清热凉血、活血解毒及透疹消斑等作用[5,6]。近年来多项研究发现紫草及其化学成分具有明显的抗肿瘤作用[7,8]。网络药理学是基于系统生物学对生物系统的网络分析，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科[9]。本研究通过网络药理学对紫草的化学成分、靶点及通路进行深入的研究和预测，发挥其天然药物独有的优势，为其治疗胃癌提供可靠依据。

1 方法

1.1 紫草有效成分的收集

主要通过TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）数据库平台（中药系统药理学数据库），点击选项“Herb name”将“紫草”作为关键词进行检索。依据OB值（口服生物利用度）≥30%、DL值（药物相似性）≥0.18及Swissadme数据库（http://www.swissadme.ch）中的药代动力学特性和药性两者均评价好的原则进行有效成分的初筛。

1.2 紫草靶点的预测及构建成分―靶点网络

将筛选出来的有效成分通过PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库获取与之相对应的SMILES号，并上传至SwissTargetPrediction数据库进行靶点预测，预测选项设置为Homo sapiens，将预测出的药物靶点输入Uniprot（https://www.uniprot.org/）数据库中转化为标准的基因名，并通过绘图软件Cytoscape构建出紫草的有效成分—靶点网络图。

1.3 胃癌的靶点收集

通过GeneCards（人类基因数据库）疾病数据库（https://www.genecards.org/）以“Gastric Cancer”为关键词进行检索，取评分高的靶点作为胃癌的靶点。

1.4 紫草与胃癌的交集靶点

利用Bioinformatics网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）的自定义绘制维恩图功能，对得到的紫草靶点和胃癌靶点进行交集，得出两者的交集靶点即紫草治疗胃癌的潜在有效靶点。

1.5 PPI（蛋白间相互作用）网络的构建

将上述得出的交集靶点导入STRING（蛋白间相互作用网络功能富集分析）数据库（https://stringdb.org/）进行分析，将物种限定为Homo sapiens，根据所需设置靶点间的要求和得分导出结果，并用Cytoscape软件对关键靶点进行PPI网络分析。

1.6 GO分析和KEGG通路分析及靶点―通路网络的构建

Metascape（https://metascape.org/gp/index.html）作为生物学数据库，结合了功能丰富、交互组分分析和基因注释等功能[10]，通过该数据库对有效靶点进行GO分析和KEGG（基因组百科全书）通路分析，将P＜0.01作为筛选条件并导出结果，再利用Cytoseape软件将KEGG分析得出的关键通路构建“靶点—关键通路”的网络。

1.7 分子对接验证

首先在PDB数据库中下载紫草关键靶点的蛋白3D图，并在PubChem数据库中下载有效成分的2D结构，通过Chem3D软件进行优化处理，并利用Py-MOL 2.4软件对有效成分进行除水、去除原配体，最后运用AutoDockVina软件进行分子对接并将结果可视化处理。

2 结果

2.1 紫草的有效成分

通过TCMSP数据库筛选出OB值≥30%、DL值≥0.18以及药代动力学特性好的紫草有效成分共12种，由于1-甲氧乙酰紫草碱无对应的靶点，最终得出活性以及药效较好的有效成分有11种，见表1。

表1 紫草有效成分Table 1 The effective components of Radix arnebia

2.2 药物靶点筛选及成分―靶点网络图的构建

对其上述11种有效成分在Swiss Target Prediction数据库中进行靶点预测，筛选出对其评分较高的靶点，将其导入Uniprot数据库对名称进行标准化处理，并进行整理及去重得出紫草的靶点有110个，通过Excel表格将有效成分和预测靶点进行整合，并通过Cytoscape软件构建出有效成分―靶点网络图，见图1。

图1 有效成分―靶点网络Fig.1 The active component-target network

2.3 胃癌靶点的收集及获取有效靶点

利用GeneCards数据库收集到胃癌靶点有11 842个，筛选出排名较前、可信度高的靶点共3 000个，将疾病和药物靶点上传至Bioinformatics网站绘制维恩图，见图2。对得出的65个有效靶点进行整理，见表2。

表2 紫草治疗胃癌的有效靶点Table 2 The effective target of Radix arnebiae in the treatment of gastric cancer

图2 药物―癌症靶点维恩图Fig.2 The venn diagram of the drug cancer targets

2.4 构建PPI网络

为全面探讨紫草对胃癌的作用机制，将得出的65个有效靶点上传至STRING数据库获得PPI网络图，其中PPI网络中包含65个节点、284条边及平均节点度8.74（图3）。将其导入Cytoscape软件中，根据节点大小筛选出排名靠前的11个关键靶点（图4），由此可见AKT1、PTGS2和PTEN等为关键靶点。

图3 紫草治疗胃癌的靶点PPI网络Fig.3 The PPI network as the target ofin the treatment of gastric cancer

图4 紫草治疗胃癌的关键靶点Fig.4 The key target ofin the treatment of gastric cancer

2.5 GO富集分析和KEGG分析

GO富集分析包括细胞组分、分子功能和生物过程3个方面[11]。将紫草治疗胃癌的65个有效靶点导入Metascape数据库进行分析，设定物种为人及P＜0.01，结果显示主要为细胞对激素刺激的反应（cellular response to hormone stimulus）、脂质生物合成过程（lipid biosynthetic process）和对酸性化学物质的反应（response to acid chemical）等9个生物过程（BP）；包括脂质结合（lipid binding）、磷酸转移酶活性（phosphotransferase activity）和转录因子结合（transcription factor binding）等10个分子功能（MF）；膜筏（membrane raft）、受体复合物（receptor complex）和核膜（nuclear envelope）等10个细胞组成（CC）。具体分析结果，见图5。

图5 紫草治疗胃癌的有效靶点GO富集分析Fig.5 The enrichment analysis of effective targets GO enrichment of Radix arnebiae in the treatment of gastric cancer

基于Metascape数据库的KEGG富集分析显示[12]，有效靶点主要涉及的通路为癌症的途径（pathways in cancer）、乳腺癌（breast cancer）、类固醇激素生物合成（steroid hormone biosynthesis）、花生四烯酸代谢（arachidonic acid metabolism）、PPAR信号通路（PPAR signaling pathway）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、肿瘤中的microRNA（MicroRNAs in cancer）、NF-B信号通路（NF-kappa B signaling pathway）和癌症中的转录失调（Transcriptional misregulation in cancer）等通路，结果见图6，其中纵轴为通路名称，横轴表示富集因素的百分比，气泡颜色和大小分别代表P值和富集靶点数，颜色越绿代表P值越小。

图6 紫草治疗胃癌有效靶点的KEGG分析Fig.6 The KEGG analysis of effective targets forin the treatment of gastric cancer

2.6 分子对接分析

为证明紫草化合物和靶点蛋白间的结合活性，通过成分―靶点网络和相关文献[13,14]报道，将谷甾醇、乙酰紫草素、油酸乙酯（NF）和紫草素等共7种有效成分与PPI中度值排名靠前的关键靶点AKT1、PTGS2、PTEN和MTOR进行对接，其结合能小于0提示配体与受体可自发结合，若结合能≤-20.9kJ/mol表明有较好结合活性，≤-29.26 kJ/mol表明有强的结合活性[15,16]。本次分子对接显示其结合能均小于0，筛选出本次对接结合能≤-20.9 kJ/mol的结果，见表3。由表3可以得出乙酰紫草素、紫草素和AKT1的结合能最佳，见图7。

图7 乙酰紫草素、紫草素和AKT1对接图Fig.7 The docking diagram of acetylshikonin,shikonin and AKT1

表3 紫草中化合物与靶点对接结合能Table 3 Docking and binding of compounds in Radix arnebiae with target

3 讨论

中药有着出色的抗癌作用，其抗肿瘤机制也是近年来的研究热点。胃癌在中医的病因病机为本虚标实，即脾虚为本，气滞、湿热和血瘀为实[17,18]。紫草作为清热药，其功效不仅限于对热证类病的治疗，在抗肿瘤方面也具有非常重要的作用。近年来随着中西医结合的兴起，越来越多的中药在癌症的治疗中起到了重要的作用。

通过对紫草有效成分的收集和筛选，得出的有效成分主要包括乙酰紫草素（acetylshikonin）、油酸乙酯（Ethyl oleate）、谷甾醇（sitosterol）、紫草素（shikonin）、亚油酸乙酯（mandenol）和磷脂酰胆碱B（lithospermidin B）等11种化合物，这些具有良好药效的成分是紫草治疗胃癌的物质基础。在上述有效成分中乙酰紫草素、谷甾醇及紫草素的研究较为广泛。张志琴等[19]收集了1977―2020年关于乙酰紫草素药理学、药代动力学的相关信息，证明乙酰紫草素具有抗癌、抗炎等作用。TOPK作为一种丝氨酸蛋白激酶，在胃癌中蛋白表达水平及活性升高，有研究证明乙酰紫草素可直接抑制TOPK活性，减少TOPK信号的磷酸化和激活，从而抑制肿瘤的生长[20,21]。孙玉成等[22]研究发现-谷甾醇能抑制胃癌细胞增殖并促进其凋亡，其机制可能与-谷甾醇通过PI3K/AKT/mTOR通路诱导细胞自噬作用相关。张哲宇等[23]在对左金丸治疗胃癌的网络药理学研究中也发现其有效成分包含谷甾醇；另外紫草素在胃癌甚至其他肿瘤研究中也有较明显的进展。梁文全等[24]通过整理分析得出由于不同肿瘤细胞系对紫草素的敏感性不同，在1～20M范围内即可显著抑制胃癌、肝癌和结直肠癌等消化系统肿瘤细胞的生长。研究表明[25]紫草素可显著抑制人胃癌细胞增殖，同时促其凋亡，其机制可能与上调人胃癌细胞PTEN蛋白表达有关。

对紫草和胃癌靶点的收集和筛选，得出紫草－胃癌有效靶点65个，将65个靶点进行PPI分析，得出关键靶点AKT1、PTGS2、PTEN和MTOR等共11个。AKT1又称为蛋白激酶B，其在胃癌组织中高表达，参与了胃癌的发生发展，有研究证明AKT1基因沉默可促进胃癌BGC-823细胞裸鼠移植瘤细胞凋亡，并增强阿霉素（广谱抗癌化疗药物）对移植瘤组织细胞凋亡的诱导作用[26,27]。赵小蕾等[28]通过生物信息学分析得出PTGS2为胃癌的关键基因。PTEN基因对于胃癌的意义重大，研究得出胃腺癌组织PTEN表达降低，与胃癌组织低分化、伴淋巴结转移和TNM分期等生物学特性有关，预示胃癌不良预后[29]。PTEN也可能是胃癌的潜在治疗靶点，下调PTEN表达可抑制胃癌的恶性生物学行为[30]。另有研究证实由MTOR组成的AKT/MTOR信号通路在胃癌细胞的生长、分化、增殖、代谢和细胞骨架重组等系列功能中发挥重要的作用，从而导致胃癌细胞凋亡或存活[31]。结合分子对接的结果说明紫草在胃癌的治疗中主要是通过AKT1、PTGS2、PTEN和MTOR等靶点发挥作用。

GO分析显示，紫草主要通过细胞对激素刺激的反应、脂质生物合成过程、脂质结合、转录因子结合、受体复合物等对胃癌产生作用。KEGG通路分析得出和紫草治疗胃癌富集的通路主要在癌症的途径、乳腺癌、肿瘤中的microRNA、IL-17和NF-B等信号通路，表明紫草具有明显的抗癌功效。研究表明，microRNA在胃癌患者中有明显的异常性表达，并对于胃癌的诊断及预后能够起重要作用[32]。李春波等[33]发现IL-17可能通过NF-B信号通路刺激IL-6参与胃癌的免疫调控以及促进胃癌的发生发展。另还有研究证明PHF5A在胃癌肿瘤细胞中呈高表达，可能为癌基因激活NF-B信号通路参与了胃癌细胞MGC803的增殖和迁移[34]。以上结果说明紫草是通过多种通路对胃癌产生治疗作用，但具体的机制还需进一步通过实验去证实。

综上所述，本研究表明紫草治疗胃癌的主要成分有乙酰紫草素、谷甾醇、紫草素、亚油酸乙酯和磷脂酰胆碱B等，主要作用于AKT1、PTGS2、PTEN、MTOR和ESR1等关键靶点以及对肿瘤中的microRNA、IL-17信号通路和NF-B信号通路等通路的调节，发挥对胃癌的治疗作用。本研究通过数据挖掘和分子对接对紫草治疗胃癌进行分析，为今后探索紫草治疗胃癌的研究奠定了基础。