法薏苡仁延缓衰老的代谢组学初步研究

2021-12-06李龙雪黄声宏徐铁龙刘隆霸顾洲洋杨志龙刘志勇江西中医药大学南昌330004

江西中医药 2021年11期

★李龙雪黄声宏徐铁龙刘隆霸顾洲洋杨志龙刘志勇（江西中医药大学南昌 330004）

衰老是机体损伤和防御相拮抗的一个复杂过程，表现为机体结构和功能的衰退，以及抵抗力和修复力的减退。近年来我国人口老龄化程度加深，应对老龄化已上升为国家战略，抗衰研究逐渐成为一个热点领域。

亚精胺是生物体内合成的一种代谢物，也见于成熟奶酪、豆类和全谷类等天然食品中。Eisenberg T等［1］研究发现，亚精胺通过激活细胞自噬，延长酵母、苍蝇、线虫的寿命，提高人外周血单核细胞的存活率，降低小鼠氧化应激反应发挥其有益的作用。Eisenberg T等［2］研究发现在小鼠饮用水中添加亚精胺可延长它们的寿命，即使在小鼠已达中年时再开始也能产生效果。Liang Y等［3］研究发现，机体衰老过程伴随着大脑线粒体功能的衰退，通过膳食补充亚精胺可改善线粒体呼吸功能和大脑的衰老进程。因此，研究通过食源性补充亚精胺是一种安全、可靠的延缓衰老方法。

薏苡仁（coicis semen），为禾本科植物薏苡成熟干燥的种仁，功能利水渗湿、健脾止泻、除痹、排脓、解毒散结。而法薏苡仁是樟帮历来使用的薏苡仁炮制品, 在《樟树药帮中药传统炮制法经验集成及饮片图鉴》中有记载, 经过了浸制、蒸制和炒制等数种复制而成［4-5］，具有很高的营养价值以及重要的药用价值［6-8］。现代药理学研究表明，薏苡仁具有抗肿瘤，增强免疫力，降血脂，镇痛消炎等作用。薏苡仁经过法制的炮制方法后，祛除了寒凉之性，药性由凉转微温，更适宜老年人群食用。民间常用作保健抗肿瘤提高免疫力的食材自主食用，探讨其对衰老的调节作用具有实际意义。

本研究选用退役雌性SD大鼠，运用代谢组学技术研究炮制后薏苡仁（法薏苡仁）对大鼠机体物质代谢的影响，进而探索法薏苡仁延缓衰老的作用，为法薏苡仁的进一步开发利用奠定基础。

1 实验材料与仪器

1.1 实验动物SPF级SD雌性大鼠33只，12月龄大鼠23只，体重（310±30）g，2月龄大鼠10只为青年对照组，体重（200±20）g，由江西中医药大学实验动物科技中心提供，合格证号：SCXK（赣）2018-0003。实验鼠用饲料原粉和垫料统一由湖北万千佳兴有限公司提供。实验大鼠饲养在江西中医药大学实验动物科技中心SPF级屏障实验室内，环境温度为20~23 ℃、湿度45 %~55 % ，使用许可号为SYXK（赣）2018-0004。

1.2 药物法薏苡仁粉由江西景德中药股份有限公司提供。

1.3 试剂质谱级甲醇、乙腈、甲酸购自Anaqua（Wilmington，DE USA）。

1.4 主要仪器高速冷冻台式离心机（Allegra X-30R Centrifuge）；Triple TOFTM 5600 型液相色谱高分辨串联质谱仪（美国AB SCIEX 公司，配备 DuoSprayTM 离子源，30A 型液相色谱系统）；超纯水机（密理博MILLI-Q-Integral 10）。

2 方法

2.1 样品配制法薏苡仁高剂量组饲料含法薏苡仁3 %（即每加入291.0 g饲料原粉加入法薏苡仁粉9.0 g）；法薏苡仁低剂量组饲料含法薏苡仁0.5 %（即每加入298.5 g饲料原粉加入法薏苡仁粉1.5 g）；青年对照组和衰老模型组饲料仅为饲料原粉。

2.2 动物分组给药与临床观察SPF级SD退役雌性大鼠33只，12月龄大鼠23只，随机分为衰老模型组（C）7只、法薏苡仁低剂量组（FL）8只和法薏苡仁高剂量组（FH）8只。2月龄青年对照组大鼠（YC）10只，每天给足量相应饲料和水，连续喂食90 d。期间，观察实验大鼠的饮食饮水情况，并观察毛发以及各组动物的临床表现。

2.3 尿液采集与处理给药90 d后用代谢笼隔夜收集4组大鼠12 h的尿液。第91 d腹腔注射3 %戊巴比妥钠麻醉解剖。

2.4 UPLC-MS/MS

2.4.1 色谱条件ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相0.1 %甲酸水溶液（A）-乙腈溶液（B）梯度洗脱（0~2 min，5 %~10 %；2~15 min，10 %~25 %；15~28 min，25 %~55 %；28~37 min，55 %~95 %；37~40 min，95 %~5 %），柱温35 ℃，进样量5 μL。

2.4.2 质谱条件质谱仪采用ESI源正负离子模式检测，质谱数据采集时间为40 min，扫描时间900 ms,采集范围m/z100~1 500 Da，雾化气压力50 psi，脱溶剂气压力50 psi,气帘气流（CUR）40 mL/min，脱溶剂气温度500 ℃，离子喷雾电压5 500 V，去簇电压（DP）100 V，质谱漂移范围50 mDa，碰撞能（CE）10 V。

2.4.3 样品前处理取1 mL尿液样本，3 000 rpm离心10 min，取300 μL上清液加入900 μL乙腈，2 000 rpm涡旋2 min，4 ℃下13 000 rpm离心15 min，吸取1 mL上清液氮气吹干，用500 μL 75 %乙腈复溶，4 ℃下13 000 rpm离心后，取适量上清液于进样瓶中进行检测。

2.5 代谢组学数据分析原始数据经ProteoWizard软件转成mzXML格式后，使用自主编写的R程序包进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，用自建二级质谱数据库匹配进行物质注释。使用SIMCA软件（V16.0.2）进行多元统计分析，主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）等方法进行分析。通过OPLS-DA模型筛选出VIP>1且P<0.05 的差异性代谢物。

2.6 统计分析使用SPSS 20 软件进行统计学分析。采用t检验(Student's t-test)比较组间差异，P<0.05认为差异有统计学意义，用斯皮尔曼相关分析进行统计学分析。

3 结果

3.1 大鼠生长状态YC组大鼠皮毛浓密、光滑有光泽，行动灵敏。C组大鼠毛色粗糙、稀松暗淡，少动。较C组大鼠相比，FH和FL组大鼠反应较为灵敏。

3.2 代谢组学方法学验证QC样本在PCA-X一维分布图（图1A-B），QC样品全部位于±2 STD之内，说明本次实验数据质量较好。

3.3 多元统计分析本实验采用正、负离子模式对4组大鼠尿液样品的代谢轮廓进行比较分析，大鼠尿液QC样本正、负离子模式总离子流图见图2，QC样品的聚集性好，检测系统相对稳定，总离子流图轮廓总体相似。

图1 大鼠尿液QC样本在PCA-X一维分布图

图2 大鼠尿液的QC样本总离子流图

经PCA处理得到的得分图能直观地显示出不同干预条件下各组研究对象代谢轮廓的变化，样本的聚集代表具有相似的代谢组分，处于相似的生理状态。图3A-B分别是正、负离子模式下各组大鼠尿液PCA得分图，由图可见实验处理90 d后，根据大鼠年龄和干预条件的不同各组样本间呈现明显的分离趋势，表明各组大鼠体内的小分子代谢产物发生了变化。为进一步建立各组间的特异性差异模型，采用OPLS-DA分析方法对各组大鼠尿液代谢组学数据展开模式识别，OPLS-DA分析方法能够更大程度的体现两组样本的聚集性和分离性。见图3C-D，证明衰老组、青年组和法薏苡仁高剂量组大鼠尿液中代谢产物的变化。

为避免过度拟合，本研究进行7倍交互验证和置换检验（n=200），结果显示模型具有较好的稳定性且不存在过拟合现象。见图3E-F。以上结果表明，本研究建立的模型有效且可用于模型差异标志物的筛选。

图3 大鼠尿液正离子模式PCA图（A）、负离子模式PCA图（B）；YC组与C组，OPLS-DA图（C），OPLS-DA置换检验图（R2Y：0.993，Q2：0.797）（E）；C组与FH组，OPLS-DA图（D），OPLS-DA置换检验图（R2Y：1，Q2：0.971）（F）

3.4 衰老模型组与青年对照组大鼠尿液生物标志物筛选与YC组相比，C组大鼠尿液正、负离子模式共鉴定出5个生物标志物，L-犬尿氨酸、硫酸脱氢表雄酮、N8-乙酰亚精胺、花生四烯酸和对甲酚。见表1。

表1 大鼠尿液衰老生物标志物

3.5 衰老模型组与法薏苡仁给药组大鼠尿液生物标志物筛选与衰老模型组相比，FH组大鼠尿液正、负离子模式下共鉴定出5个生物标记物，N8-乙酰亚精胺、熊去氧胆酸、吲哚乙酸、皮质酮、和对甲酚。见表2。

表2 大鼠尿液法薏苡仁生物标志物

3.6 年龄与衰老相关生物标志物相关性分析运用斯皮尔曼相关系数分析年龄与L-犬尿氨酸和对甲酚呈极显著正相关（P<0.01），与硫酸脱氢表雄酮、N8-乙酰亚精胺和花生四烯酸呈显著负相关（P<0.05）。见表3。对甲酚、熊去氧胆酸和对甲酚之间呈极显著正相关（P<0.01）。见表4。

表3 年龄与衰老生物标志物的相关性分析

表4 对甲酚、吲哚乙酸和熊去氧胆酸间相关性分析

4 讨论

本实验基于代谢组学技术共筛选出5种衰老相关生物标志物，通过生物学功能分析，均能较好地反应衰老人群机体的代谢特征。吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）是催化色氨酸沿犬尿酸途径分解代谢的限速酶，其在免疫抑制和自身免疫中的具有重要作用。IDO活性的增强可使L-色氨酸的分解代谢增强进而使血清L-犬尿氨酸水平的升高，（本实验结果衰老组尿L-犬尿氨酸水平升高）。Ladomersky E等［9］发现与青年人相比老年人脑中IDO mRNA表达显著增加，并与外周血中循环免疫抑制树突状细胞比率正相关，提出了IDO抑制老年人机体免疫功能的假说。本实验研究发现，C组较YC组大鼠尿液中L-犬尿氨酸相对含量显著升高，相关性分析显示年龄与L-犬尿氨酸呈极显著正相关（P<0.01），验证了这一假说。

前列腺素等二十碳衍生物对人体心血管系统及免疫系统具有十分重要的作用。作为这类生物活性物质的直接前体，花生四烯酸具有酯化胆固醇、增加血管弹性、降低血液粘度，调节血细胞功能等一系列生理活性，对预防心血管疾病、糖尿病和肿瘤等具有重要功效［10-11］。本实验研究发现，衰老大鼠尿液中花生四烯酸相对含量显著降低，相关性分析显示年龄与花生四烯酸呈显著负相关（P<0.05），推测衰老大鼠机体可能因花生四烯酸代谢异常导致免疫系统受损。

硫酸脱氢表雄酮（DHEA-S）是类固醇激素生物合成中重要的中间产物，是脱氢表雄酮（DHEA）在体内的游离形式，其随循环系统到达相应靶组织，进而转化成雄激素和雌激素发挥其生物学作用。Chehab Olfa等［12］通过观察突尼斯老年人群DHEA-S与年龄的关系，发现随着年龄的增长，C-19类固醇激素的分泌（DHEA和DHEA-S）下降。本实验结果显示，DHEA-S随年龄的增长而降低（P<0.05），相关性分析显示年龄与DHEA-S呈显著负相关（P<0.05），实验结果符合老年人群代谢变化。

N8乙酰亚精胺（N8-AcSpd）是亚精胺乙酰化衍生物，在细胞生长和分化发挥重要作用。Stefania等定量分析了长寿、老年和青年/成年健康献血者全血中亚精胺含量，长寿和青年/成年组亚精胺水平显著高于老年组，且长寿和青年/成年组亚精胺的水平相当。健康人体尿液中的多胺水平与年龄有关，随着年龄的增长逐渐减少［13-15］。本次实验中，C组较YC组大鼠尿液N8-AcSpd水平显著降低，相关性分析显示年龄与N8-AcSpd呈显著负相关（P<0.05）。有学者认为，通过摄入富含亚精胺的食物、增加体内亚精胺的生物合成，或者增加肠道中合成亚精胺的益生菌活性等方式，将老年人体内下降的亚精胺水平恢复到年轻个体的生理水平可能是更可行的延缓衰老的有效途径［16-17］。本实验发现FH、FL组较C组大鼠尿液中N8-AcSpd水平显著提高（P<0.01），推测法薏苡仁可通过某种途径提高体内N8-AcSpd的水平逆转衰老机体的代谢变化。

对甲酚是肠道菌群代谢色氨酸的代谢产物，其在体内的含量主要受饮食影响，健康人群高蛋白饮食可使对甲酚血清含量升高。有研究发现［18］，健康人群随着年龄的的增长对甲酚体内含量升高。本实验结果显示，与YC组比较，C组大鼠尿液中对甲酚含量显著升高（P<0.01），相关性分析显示年龄与对甲酚呈极显著正相关（P<0.01），与衰老人群机体代谢变化一致。与C组相比，FH和FL组大鼠尿液中对甲酚含量显著下降（P<0.01），具有剂量-效应关系，其变化趋势向YC组变化。吲哚乙酸是色氨酸在肠道分解的代谢产物，主要由肠道益生菌：生孢梭菌和消化链球菌代谢产生，其可促进肠上皮屏障保护功能，并能显著降低免疫细胞的炎症反应［19］。本实验结果显示，与C组比较，FH和FL组大鼠尿液中吲哚乙酸的含量显著下降（P<0.01）。由此推测法薏苡仁可能主要通过改变肠道菌群分布，影响色氨酸的代谢，进而改变对甲酚在体内的含量，同时增加体内吲哚乙酸的生物利用度，降低由机体衰老导致的肠道炎症反应，改善衰老机体的代谢环境。

随着年龄的增长或在各种条件刺激下，机体内将会大量产生活性氧（ROS）和/或活性氮（RNS），发生氧化应激，如不能被及时清除，将有助于肠道疾病的发生。熊去氧胆酸（UDCA）具有抗氧化，抗凋亡和抗自噬的作用，可阻断促谷胱甘肽耗竭药物对机体造成的损伤［20-21］。本实验中FH组较C组大鼠尿液中，熊去氧胆酸含量显著下降（P<0.01），推测法薏苡仁可能通过增加UDCA的利用率，加强衰老大鼠肠道抗氧化作用。通过相关性分析发现，对甲酚、吲哚乙酸和熊去氧胆酸具有极显著的正相关（r>0.6，P<0.01），三者之间变化具有协同性，可能在代谢过程中处于较为接近的反应步骤。由此推断，法薏苡仁可能通过降低肠道炎症反应和抗氧化作用发挥抗衰老的作用。