炎调方对脓毒症大鼠肠道微生态环境的影响研究*

王 柳 李淑芳

（上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021）

脓毒症是一种由感染引起的生理、病理和生化异常综合征，发病率和病死率高［1］。国外一项基于7个高收入国家的脓毒症流行病学调查估计，全球每年可有3 150万例脓毒症病例，并有530万病例死亡［2］，平均每人花费3.2万美元［3］。随着脓毒症与肠道菌群研究的深入，目前发现脓毒症与肠道菌群之间存在密切关联，为探索脓毒症的发病机制与治疗开辟了新的研究方向。前期临床研究已证实炎调方可调控脓毒症大鼠及患者的白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子水平，减轻炎症反应，从而降低脓毒症患者的病死率［4］。据此可以猜测，炎调方正是通过调节肠道菌群来减轻炎症反应，达到治疗脓毒症的作用。本研究旨在探讨炎调方对脓毒症大鼠肠道微生态环境的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40只SPF级SD大鼠，体质量（200±20）g，由上海西普尔-必凯有限责任公司提供，实验动物许可证号：SCXK（沪）2013-2016，实验动物批号：1910150023。大鼠饲养于上海中医药大学实验动物中心，室温22～24℃，相对湿度40%～60%。每5只装1个鼠笼，自由饮水，进食普通标准饲料，每天7∶00～19∶00予以光照，适应性饲养1周后进行试验。

1.2 实验药物

炎调方由生大黄9 g（后下），芒硝10 g（冲），桃仁10 g，玄参15 g，赤芍15 g，当归15 g，金银花15 g，连翘15 g，麦冬10 g组成。以上药物购自曙光医院，采用药物免煎剂，将药物加入等体积蒸馏水，使药液浓缩成含生药1.0 g/mL，置4℃冰箱保存备用。双歧杆菌三联活菌胶囊（培菲康，产自上海上药信谊药厂有限公司，国药准字 S10950032，含菌量 5.8×1010CFU/g），使用时将0.035 g粉剂倒入eppendorf管中，加入2 mL的等渗NaCl溶液混匀，含益生菌≥1×109CFU/mL。

1.3 试剂与仪器

DNA抽提试剂盒DNeasy® PowerSoil® Pro Kit购自QIAGEN公司。建库试剂盒NEXTFLEX Rapid DNASeq Kit购自Bioo Scientific公司，测序试剂盒MiSeq Re⁃agent Kit购自Illumina公司，以上试剂盒均由上海美吉生物医药科技有限公司提供。ELISA试剂盒（IL-8、IL-10和TNF-α）购自上海威奥有限公司。灌胃针、眼科剪、眼科镊、血管钳、手术缝针、手术缝线、穿刺针、冻存离心管、电子天平均由上海中医药大学实验动物中心提供。

1.4 分组与给药

采用完全随机设计，以SPSS25.0生成随机数字，将40只SD大鼠随机分为5组：假手术组、模型组、炎调方组、益生菌组、炎调方+益生菌组，每组8只。各组均常规饲养。假手术组、模型组以生理盐水2 mL连续灌胃3 d，每天1次；参考《药理实验方法学》［5］，换算大鼠使用的炎调方剂量为9.8 g/（kg·d），炎调方组以炎调方（9.8 g/kg）灌胃3 d，每天1次；益生菌组以益生菌灌胃（LGG 1×109CFU/mL）灌胃3 d，每天1次；联合组以炎调方（9.8 g/kg）和益生菌灌胃（LGG 1×109CFU/mL）灌胃3 d，每天1次。

1.5 模型制备［6］

各组均于第3次灌胃2 h后造模。大鼠经2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后剃去腹部被毛，75%酒精消毒腹部皮肤，沿腹中线位置剪开1～2 cm，分离表皮和肌层，找到盲肠，小心分离盲肠，避免损伤肠系膜血管。在盲肠长度1/2或3/4的位置用3号线结扎，结扎后使用8号针头来回贯穿两次，从针孔挤出少量肠内容物，将盲肠放回腹腔，尽量避免肠内容物黏附在手术切口，逐层缝合肌肉层和皮肤。术后予生理盐水（30 mL/kg）皮下注射预防休克。假手术组麻醉后开腹翻动盲肠，随即关腹。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 粪便标本采集与16Sr DNA测序 单手捏住颈后皮毛将其提起，另一只手固定尾部（灌胃和腹腔注射样姿势），待大鼠自然排便后收集于5 mL Ep管中，-80℃保存，干冰寄送。基于Illumina Miseq PE300平台进行16Sr DNA测序。粪便标本经研磨、震荡、离心、洗脱得到总DNA。完成DNA抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。利用338F_806R引物（F端序列：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，R端序列：GG ACTACHVGGGTWTCTAAT）对V3～V4可变区进行PCR扩增。将纯化后的PCR产物进行定量与均一化，构建Miseq文库，最后借助Illumina Miseq PE300平台进行16Sr DNA测序。Miseq测序得到的原始序列首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后按照97%的相似度进行OTU聚类，得到原始OTU表。测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.6.2 血清标本采集与炎症因子（IL-8、IL-10和TNF-α）检测 2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，固定于固定架，剪去腹正中毛发，安尔碘消毒皮肤，置于超净台，铺巾。用无菌手术器械沿腹正中线逐层剪开，拉出肠等腔内器官，打开后腹膜层，暴露腹主动脉，以5 mL无菌注射器缓慢抽血，装入非抗凝无菌管中，以3 000 r/min离心15 min，取上清，分装，-80℃保存。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定大鼠血清IL-8、IL-10和TNF-α，参照试剂盒说明书上操作方法进行检测。

1.7 统计学处理

以SPSS25.0及美吉生物云平台进行数据处理。计量资料以（±s）差表示，符合正态分布且方差齐性的采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验；不符合正态分布且方差不齐的采用秩和检验。计数资料以率或百分比表示，采用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组炎症因子水平比较

见表1。与假手术组比较，模型组IL-8、TNF-α水平升高，IL-10水平下降，差异有统计学意义（P<0.01）。炎调方组、益生菌组和联合组TNF-α水平高于假手术组，差异有统计学意义（P<0.05），IL-10水平低于假手术组，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，炎调方组、益生菌组和联合组IL-8水平、TNF-α水平均较模型组降低，IL-10水平均较模型组升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与炎调方组比较，IL-10水平益生菌组降低，联合组升高，差异均有统计学意义（P<0.01）；TNF-α水平益生菌组、联合组均升高，差异有统计学意义（P<0.01）。

表1 各组炎症因子水平比较（pg/mL，±s）

表1 各组炎症因子水平比较（pg/mL，±s）

注：与假手术组相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01；与炎调方组相比，#P<0.05，##P<0.01。下同。

组别假手术组模型组炎调方组益生菌组联合组n 8 8 8 8 8 IL-8 27.38±18.38**55.01±10.23▲▲29.06±4.60**28.89±3.15**37.19±9.17**IL-10 46.16±6.44**##17.26±3.76##▲▲30.59±4.76**▲▲24.37±2.52**##▲▲38.79±2.88**##▲▲TNF-α 163.43±31.58**#513.69±41.35##▲▲225.46±37.89**▲262.67±49.82**▲▲392.10±103.55**##▲▲

2.2 各组测序数据统计

对5组CLP脓毒症大鼠共40个样本进行测序，得到有效序列数为1 921 430，有效碱基数为811 500 698 bp，平均序列长度为422.34。按最小样本序列数对原始OTU表进行抽平后用于后续分析。随着测序数量的增加，泛物种逐渐增加，核心物种逐渐减少，两者曲线趋于平缓，根据Pan/Core曲线评估显示样本量充足，见图1。

图1 样本测序曲线

2.3 各组肠道菌群α多样性指数分析

见表2。与假手术组比较，模型组simpson指数升高（P<0.01）。与模型组比较，炎调方组sobs指数升高（P<0.05），shannon指数升高（P<0.01），simpson指数降低（P<0.05）。与炎调方组比较，益生菌组shannon指数降低（P<0.01），simpson指数升高（P<0.01）；联合组sobs指数和shannon指数均降低（P<0.01或P<0.05），simpson指数升高（P<0.05）。

表2 各组肠道菌群α多样性指数分析比较（±s）

表2 各组肠道菌群α多样性指数分析比较（±s）

images/BZ_43_1248_577_2252_643.png 假手术组模型组炎调方组益生菌组联合组88888 213.30±29.70 227.10±38.30#262.60±20.70▲▲*239.30±25.40 240.50±17.30▲#3.10±0.30 2.90±0.40##3.50±0.10▲▲**3.20±0.20##3.20±0.20##0.10±0.03 0.13±0.08▲▲#0.06±0.01▲▲*0.09±0.02##0.09±0.03#

2.4 各组肠道菌群LEfSe多级物种差异判别分析

在α多样性指数基础上，进一步进行肠道菌群结构分析，即采用线性判别分析（LDA）估算物种丰度对多样性指数组间差异的影响大小，LDA阈值为2，结果见表3，图2～图4。1）在模型组中，理岩菌科（Rikenel⁃laceae）、黄杆菌科（Flavobacteriaceae）和葡萄球菌科（Staphylococcaceae）存在高丰度，差异有统计学意义（P<0.05）；疣微菌门（Verrucomicrobiota）丰度相较于其他各组大大减低，差异有统计学意义（P<0.05）。2）益生菌 组双歧杆菌（Bifidobacteriaceae）存在高丰度（LDA值=2.50，P<0.001）。3）炎调方组疣微菌门存在高丰度，均高于其他各组（LDA值=4.11，P<0.05）。

表3 各组肠道菌群LEfSe多级物种差异判别分析

图2 各组理岩菌科、黄杆菌科丰度比较

图3 各组葡萄球菌科、双歧杆菌科丰度比较

图4 各组疣微菌门丰度比较

3 讨论

肠道被认为是脓毒症和多脏器功能障碍的“始动器官”和关键的促炎器官［1］，肠道微生态失调是导致脓毒症免疫炎症失衡以及多脏器功能障碍的核心。脓毒症时，细胞旁通透性增加［7-8］，从而增加肠黏膜的通透性。此外，脓毒症患者的肠上皮细胞凋亡显著上升，进一步降低了肠屏障功能，并因此导致肠道菌群易位。Robert P.Dickson等的实验表明肺菌群中肠道细菌的富集与急性全身性炎症的严重程度相关［9］。目前已有实验证明肠道菌群与脓毒症免疫炎症反应有密切关系［10-12］。因此，逆转脓毒症时的肠道菌群失衡可能是改善脓毒症全身炎症反应的突破口。

实验研究发现，大鼠、小鼠的肠道菌群主要为拟杆菌门、厚壁菌门，其次为变形菌门、放线菌门和疣微菌门等，与人体相似［13］。目前针对脓毒症肠道菌群的调控，仅限于益生菌、益生元和粪便菌群移植（FMT）的应用等，但是FMT技术并不成熟。因此，调节肠道菌群药物和方法的局限性为探究中医药干预肠道菌群提供了更大的空间。

脓毒症属于中医学“热病”范畴，发病关键为热、毒、瘀。本课题组总结脓毒症的病机为热毒积聚，毒陷入腑，致腑实营热，治疗上当以通腑、清热、活血为要［14］。炎调方全方一通腑气，畅达气机；二解热毒，拔本塞源；三护阴津，阴阳和合。由于炎调方的目标作用器官在肠腑，且前期临床试验已证实炎调方可降低IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α水平以减轻脓毒症患者和脓毒症大鼠的炎症反应［4，15］。故此，本实验以肠道菌群为切入点，通过益生菌、炎调方等不同的干预方式，探究炎调方对肠道菌群的调控作用是否是其治疗脓毒症的潜在机制。

本研究结果显示，模型组较假手术组IL-8、TNF-α水平升高，IL-10水平下降，说明CLP造模成功。炎调方与益生菌联合应用对于调控IL-10水平效果比单用炎调方效果显著，而在调控TNF-α水平方面，炎调方优于益生菌组和炎调方+益生菌组。炎调方的干预成功减轻了脓毒症大鼠过度的炎症反应。在α多样性分析中，以sobs指数反映群落丰富度，其与群落丰富度呈正相关；以shannon指数、simpson指数反映群落多样性，shannon指数与群落多样性呈正相关；simpson指数与群落多样性呈负相关。脓毒症大鼠肠道菌群结构发生了变化，模型组shannon指数较假手术组减低，simp⁃son指数升高，反映了脓毒症大鼠肠道菌群多样性降低。炎调方、益生菌、炎调方和益生菌联合干预均可以提高脓毒症大鼠肠道菌群多样性，炎调方组优于两外两组。本实验中并未发现在提高肠道菌群多样性方面，益生菌与炎调方二者之间存在协同性。

在α多样性指数分析基础上，我们进一步采用LDA分析筛选对组间差异影响较大的物种。结果发现，模型组中存在高丰度且具有统计学意义的菌群为黄杆菌科（Flavobacteriaceae）、理岩菌科（Rikenellace⁃ae）和葡萄球菌科（Staphylococcaceae）。现有研究发现，黄杆菌科可能是替加环素抗性基因tet（X）的潜在祖先来源［16］，布洛芬等非甾体抗炎药物的使用可以增加理岩菌科的细菌数量［17］，金黄色葡萄球菌是常见的致病菌，可引起皮肤和软组织感染、手术部位感染、肺炎和败血症等多种疾病［18-19］。而益生菌组双歧杆菌的高丰度极可能由培菲康干预导致。另外，疣微菌门作为炎调方组区别与其他各组的菌种，其与炎调方作用机制可能存在潜在关联，需今后进一步探索研究。本实验的优势在于通过炎调方与益生菌干预的对照，明确了炎调方在减轻过度的炎症反应和提高脓毒症大鼠肠道菌群多样性方面的优势，并且排除了临床上抗生素应用、喂养方式以及大便标本采集时间和不同感染部位等多因素对肠道菌群的干扰。但是本实验采用统一的创伤性造模方式，与临床上非创伤性感染引起的脓毒症存在差异。在肠道菌群丰度和多样性方面，炎调方组、益生菌组和炎调方+益生菌组均高于假手术组这一现象需进一步实验验证。

综合以上分析，炎调方在调控脓毒症大鼠炎症因子水平，减轻过度的炎症反应的同时，可以提高脓毒症大鼠肠道菌群多样性和丰富度。其减轻炎症反应与调节肠道菌群之间的关联机制有待进一步研究。