扶正固本汤联合穴位贴敷对咳嗽变异性哮喘大鼠IL-4、IL-10、TGF-β的影响研究*

李雨鹏 宓 丹 潘 冲 李晓梅

（辽宁中医药大学附属第二医院，辽宁 沈阳 110032）

咳嗽变异性哮喘（CVA）是一种以慢性咳嗽为主症的呼吸道疾病，在就诊的慢性咳嗽中占14%～62%，是慢性咳嗽的主要原因之一［1］。近年来由于环境因素影响CVA的患病率呈上升趋势［2］。目前CVA治疗主要以支气管扩张剂、吸入性糖皮质激素等为主，尽管这些药物取得了较好的临床疗效，然而长期应用带来的高血糖、骨质疏松等副作用不容忽视。同时，这些治疗并不能有效预防复发，减缓气管重塑的发生。因此，需要寻找一种安全有效的治疗方法。

中医药治疗CVA在减轻气道炎症、降低气道高反应性，抑制气道重塑等方面具有多靶点的作用［3］。扶正固本汤联合“伏九贴”穴位贴敷是本科室基于“冬病夏治”理论研制的治疗CVA有效方法，临床疗效显著，但作用机制不清。近年来研究表明，免疫失衡是导致CVA发病的重要因素［4］。因此本研究从免疫相关因子角度，来阐述“伏九贴”联合“扶正固本汤”治疗CVA的部分机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性大鼠180～200 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0002。动物饲养条件：室温22～24℃，湿度65%左右，复合鼠饲料喂养。

1.2 试剂及仪器 卵蛋白（OVA）：美国Sigma公司；氢氧化铝干粉［AI（OH）3］、辣椒素：北京百奥莱博科技有限公司；白细胞介素-4（IL-4）酶联免疫试剂盒、白细胞介素-10（IL-10）酶联免疫试剂盒、转化生长因子-β（TGF-β）酶联免疫试剂盒：武汉博士生物技术有限公司。动物超声雾化器：江苏鱼跃医疗设备股份有限公司。石蜡包埋机：德国LEICA公司。病理切片机：德国LEICA公司。电热恒温水浴箱：北京国华医疗仪器厂。酶标仪：BENCHMARK，BIO-RAD。Leica显微镜：DM2000徕卡显微系统（上海）贸易有限公司。

1.3 实验药物 扶正固本汤，组成：党参25 g，佛手15 g，茯苓 25 g，炙甘草15 g，芥子 5 g，桔梗 15 g，半夏15 g，山药20 g，山茱萸15 g，五味子15 g，蝉蜕15 g。药材用中药煎药机煎煮，含生药3.0 g/mL。伏九贴：延胡索、细辛、白芥子等药碾成粉末，姜汁调成膏状。地塞米松片（天津天药药业有限公司，国药准字H12020686，规格：0.75 mg×100片）。

1.4 分组及造模 将SPF大鼠随机分为空白组、模型组、治疗组、地塞米松组，每组10只。根据文献采用OVA联合Al（OH）3多次激发致敏法制备CVA模型［5］。除空白组外，其余各组第1日腹腔注射2 mg卵蛋白OVA和100 mg的AI（OH）3，14 d后再次腹腔注射2 mg卵蛋白OVA和100 mg的Al（OH）3，空白组同时注射等量的生理盐水。第15天后除空白组，其余各组予以1%OVA雾化，空白组用生理盐水雾化，每日1次，共7 d。以大鼠出现呼吸急促、腹肌收缩、咳嗽等表现确定模型成功。

1.5 药物干预 末次雾化结束24 h后各组予相应药物。1）治疗组：扶正固本汤6 g/（kg·d）灌胃，给药体积设为1 mL/100 g，同时将伏九贴敷药贴制成0.5 cm×0.5 cm大小，厚度为0.3 cm的药饼，贴于背部相应穴位处［大椎（双侧）、肺俞（双侧）、膏肓（双侧）、膻中］，用胶布固定，每日1次，每次1.5 h，持续14 d。2）地塞米松组：0.5 mg/（kg·d）地塞米松灌胃，给药体积设为1 mL/100 g，每日1次，用生理盐水浸纱布敷贴于相应穴位处，每日1次，持续14 d。3）模型组、空白组：生理盐水10 mL/（kg·d）灌胃，用生理盐水浸纱布敷贴于相应穴位处（同治疗组），每日1次，持续14 d。

1.6 观察指标 1）观察各组大鼠咳嗽次数变化情况：实验结束后，将大鼠分组放入玻璃罩中，雾化10-4mol/L辣椒素溶液60 s（雾化流量3 mL/mim），记录2 min内各大鼠的咳嗽次数。2）IL-4、IL-10、TGF-β含量：动物处死后取颈部、前胸正中皮肤切口，打开胸腔，用手术线结扎右主支气管，于左侧主支气管进行气管插管，在气管中下1/3处做一切口，将灌洗针插入气管并结扎固定，进行支气管肺泡灌洗。用注射器抽取预热的生理盐水（37℃）2.5 mL缓慢注入大鼠肺组织中，保留20 s，缓慢抽回。反复注入抽回操作5次，回收肺泡灌洗液（BALF），每只大鼠各收集BALF 10 mL，4℃保存。向5个稀释标准品的EP管中预先加入250 μL的标准品稀释液，再进行倍比稀释。将标准品稀释液直接作为空白孔。设标准孔5孔，分别依次加入50 μL不同浓度的标准品，待测样品孔加待测BALF 50 μL，空白孔加50 μL。覆膜，37℃水浴箱孵育1 h。取出后洗涤，每孔加抗体工作液100 μL，覆膜，37℃孵育1 h。重复洗板3次，甩干。每孔加入酶结合工作液100 mL，覆膜，37℃水浴箱孵育30 min。重复洗板3次。每孔加入底物溶液100 μL，覆膜，37 ℃避光显色。加入终止液50 μL，终止反应，蓝色立即转变黄色。在450 nm波长处用酶标仪测定各孔吸光度（OD）值，用OD值作为横坐标，标准品浓度作为纵坐标，绘制出标准曲线图。根据待测样品的OD值，由标准曲线得到其浓度，计算出结果。3）气管及周围组织形态结构观察：取大鼠左肺中叶放入4%甲醛溶液中浸泡固定，脱水，石蜡包埋切片，脱蜡，HE染色，显微镜下400倍观察气管及其周围组织形态、结构。

1.7 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。实验数据符合正态分布的计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析处理，采用LSD检验。不符合正态分布的，采用非参数Kruskal-Wallis检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠体征及咳嗽次数比较 见表1。空白组大鼠一般状态较好，呼吸平稳，毛色光泽，激发后伴有轻微咳嗽。模型组致敏后大鼠精神状态较差，毛色失去光泽，反应缓慢，激发后出现不同程度的咳嗽，口鼻分泌物较多。地塞米松组、治疗组致敏后大鼠表现与模型组相似，经14 d治疗后两组整体状态显著好转，地塞米松组、治疗组2 min内咳嗽次数较模型组比均显著减少，组间差异有统计学意义（P<0.05）。

表1 各组大鼠2 min内咳嗽次数比较（次，±s）

注：与模型组比较，*P<0.05。

images/BZ_39_165_1052_1169_1118.png1.70±0.67 8.40±1.26 5.00±0.81*4.80±0.63*空白组模型组地塞米松组治疗组10 10 10 10

2.2 各组大鼠肺部组织观察 见图1。经HE染色后气管周围的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞呈蓝色。空白组：肺泡结构清晰，肺泡上皮完整，气管壁不增生，气管上皮完整，腔内无渗出液。模型组：气管周围可见大量炎性细胞浸润，管腔变窄，黏膜水肿，结缔组织轻度增生。地塞米松组、治疗组同样存在不同程度的气管腔狭窄，炎性细胞浸润，但较模型组程度减轻。

图1 各组大鼠肺部组织观察（HE染色，400倍）

2.3 各组大鼠BALF中IL-4、IL-10、TGF-β的含量比较 见表2。与空白组比，模型组BALF液中致炎因子IL-4显著升高（P<0.05），地塞米松组、治疗组可以抑制IL-4的表达，与模型组比差异有统计学意义（P<0.05）。地塞米松组IL-4与治疗组之间差异无统计学意义（P>0.05）。与空白组比，模型组BALF液中抑炎因子IL-10、TGF-β显著下降（P<0.05），地塞米松组、治疗组可以促进IL-10、TGF-β水平的表达，与模型组比差异有统计学意义（P<0.05）。地塞米松组与治疗组之间TGF-β含量差异无统计学意义（P>0.05）。治疗组IL-10含量显著高于地塞米松组（P<0.05）。

表2 各组大鼠BALF中IL-4、IL-10、TGF-β的含量比较（pg/mL，±s）

表2 各组大鼠BALF中IL-4、IL-10、TGF-β的含量比较（pg/mL，±s）

注：与模型组比较，*P<0.05；与地塞米松组比较，△P<0.05。

组别空白组模型组地塞米松组治疗组n 10 10 10 10 IL-4 26.79±1.20 37.90±1.23 31.84±1.97*32.78±2.01*IL-10 37.27±2.53 33.40±1.80 38.29±2.18*40.92±2.23*△TGF-β 32.93±1.65 27.96±2.12 31.86±2.85*31.85±2.86*

3 讨论

CVA在中医典籍中归为“久咳”“顽咳”“风咳”等范畴，主要病理因素是“伏风”［6］。风邪侵入人体后失治、误治，或先天禀赋不足，以致“风伏于肺络”成为“伏风”，再次感邪后引发伏风，内外合邪阻碍肺宣降功能以致患者咳嗽不止［7］。邪伏于内，其气必虚，故治疗应外散风邪，内补肺脾肾之气以去除“伏于肺络之风”。伏九贴是本院名老中医郭振武教授依据“冬病夏治”理论研制的治疗咳喘病的有效方剂，具有温补肺气，止咳平喘的功效［8］。扶正固本汤中用党参、山药、山茱萸补脾、肺、肾之气，以培本固元；佛手、茯苓调理气机以防滋腻过甚；白芥子、半夏降逆化痰，蝉蜕疏散内外风邪，桔梗宣气止咳，五味子收敛肺气，炙甘草调和诸药。诸药共用具有补肺脾益肾、祛风散邪、止咳平喘的功效。本研究结果提示扶正固本汤联合伏九贴穴位贴敷能够减少CVA模型大鼠咳嗽次数。

近年来研究认为免疫学机制在CVA的发病过程中扮演重要角色。初始的T淋巴细胞在不同的微环境中分化成不同的亚群，各亚群处于动态平衡中，维持机体正常的免疫功能。而Th2亚群的过度活化，导致T淋巴细胞亚群之间的平衡打破，致炎因子过度分泌被认为是CVA发生的免疫学机制［9］。Th2在CVA中发挥的作用与其分泌的细胞因子IL-4密不可分［10］。IL-4是强大的致炎因子，在CVA患者早期就呈高表达状态，并且IL-4的表达水平常常被作为判定CVA疗效的细胞因子之一［11］。IL-4可以调节多种细胞因子的分泌水平，使气道内聚集多种炎症细胞，成为慢性气道炎症形成的源头之一［12］。调节性T细胞（Treg）是一种免疫抑制T细胞，能够抑制效应性T细胞的表达，当Treg的分化不足和出现功能缺陷时，过敏性疾病就会发生［13］。IL-10和TGF-β是由Treg细胞分泌的两种标志性因子［14］，IL-10能够抑制各种炎性因子的分泌和自身的免疫应答，在哮喘患者血清中表达水平显著低于健康者，并与哮喘严重程度呈反比［15］。TGF-β在哮喘炎症反应中能抑制T淋巴细胞向Th2型转化，还能通过增加转录因子FoxP3的表达促进Treg的分化，间接抑制Th2免疫反应，减少嗜酸性粒细胞的浸润［16］。CVA大鼠经扶正固本汤联合穴位贴敷或地塞米松治疗后，与模型组比肺支气管周围炎症细胞浸润程度减轻，肺泡灌洗液中炎性介质下降，抗炎因子含量升高。因此，本实验研究认为扶正固本汤联合穴位贴敷能够抑制IL-4的表达，并促进IL-10、TGF-β的表达，减轻气道炎症，与糖皮质激素作用相似。但其在促进IL-10表达上更优于糖皮质激素，这提示扶正固本汤联合穴位贴敷在治疗CVA中可能更偏重于促进抗炎因子的表达，这也正体现了扶正固本汤联合穴位贴敷通过“扶正”达到“祛邪”目的的方义。

引发CVA的免疫机制非常复杂，经典的Th1/Th2失衡无法完全解释CVA的发病机制，越来越多的研究发现CVA患者中存在Treg/Th2失衡。本实验研究通过扶正固本汤联合穴位贴敷对Th2、Tregs效应因子的研究初步推测扶正固本汤联合穴位贴敷能够纠正Th2/Tregs的失衡，但其具体的治疗靶点将在今后的研究中进一步验证。