核酸治疗在宫颈癌中的应用

武 勇，孟宪梅，江振宇，王 晶，张静洁，周 怡，年嫒嫒

(包头医学院第二附属医院内蒙古消化病研究所，内蒙古 包头 014030)

目前在世界范围内，宫颈癌的发生严重威胁着女性的健康。据了解全球每年新患宫颈癌的人数超过50万人，已成为继乳腺癌之后危害广大妇女健康的第二大杀手。经流行病学统计分析及分子生物学证实，人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPVs)感染尤其是高危型HPVs与宫颈癌的发生存在着密切的病因学关系。而高危型人HPVs 尤其是高危型HPVs 16 E6/E7 两个癌基因在宫颈癌的发生发展中起着重要的作用。经研究发现HPVs E6/E7在被HPVs感染的组织中持续保留并表达，并在使细胞发生恶性转化方面起着至关重要的作用，因此成为宫颈癌核酸治疗的理想靶点。反义技术包括反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，AS-ODNs)及核酶 (ribozymes， RZs)技术。应用反义核酸技术抑制HPV16 和HPV18 E6/E7 转录，阻止目的基因表达从而消除HPVs致癌作用。而目前，具有基因敲除效应的RNA干扰技术的出现，为宫颈癌治疗的治疗带来了广阔的前景。

1 人乳头瘤病毒与宫颈癌

HPVs感染是最常见的肛门生殖器恶性肿瘤的病因。目前已克隆鉴定的HPVs亚型已超过100多种，根据致病力的大小，可将HPVs分为高危型HPVs(High risk-HPVs，HR-HPVs)和低危型HPVs(low risk-HPVs，LR-HPVs)。通过大量的流行病学和分子生物学统计研究表明，HR-HPVs特别是HPV16 及HPV 18与宫颈癌的发生发展有着密切的病因学关系。

HPVs为无包膜的小型双链环状DNA病毒，属乳多空病毒科A亚群内的一组病毒，有高度种属特异性和特异的嗜上皮性。HPVs基因组不同区域基因与HPVs的功能存在着密切的关系，包括编码区与非编码区。编码区基因可分为3个功能区：早期区(early region)、晚期区(late region)和长控制区(long control region，LCR)。早期区编码的E1、E2、E4和E5与病毒基因的复制、转录调节等有关，而早期区的E6和E7是感染细胞发生转化和恶性表型维持的先决条件；晚期区基因编码主要衣壳蛋白及次要衣壳蛋白，执行着组装成病毒样颗粒的作用；长控制区又称上游调节区(URR区)，含有很多与病毒DNA复制和转录调节及表达所必需的调控元件。由此可见病毒基因的表达受病毒及宿主细胞的转录因子调控，其中包括 E2 ，LCR 及细胞内反式调节因子，它们的改变可使转化蛋白过表达而致瘤[1-2]。

2 核酸治疗的分子靶点

宫颈癌发生与发展过程中，E6/E7在被HPVs感染的组织中持续保留并表达，尤其在使被感染的组织发生恶性转化方面中起着重要的作用[3-4]。

HPV16 E6降解 p53是使细胞发生恶性转化的关键。抑癌蛋白p53，主要功能是参与细胞周期负性调控、促进细胞凋亡、DNA复制及损伤后的修复，从而能够稳定基因组和抑制突变细胞的产生，避免肿瘤的发生[4]。HPV16 E6蛋白可通过 E6-AP 的介导，促使 p53 蛋白进入泛素依赖降解途径，p53 蛋白降解，使G1/S期G2/M期的调控点失控，此时被感染的细胞可以克服因遗传物质损伤引发的细胞周期停止，从而导致DNA完整性受损的细胞得以过度增殖，从而致使基因突变几率增加和细胞染色体不稳定，另外还可使外源DNA整合到宿主染色体中的几率升高，从而导致肿瘤发生[4]。

端粒是真核细胞生物染色体末端DNA的一段富含C的重复序列与结合蛋白组成的复合体，端粒的功能是为染色体加“帽”及加“尾”，以防止染色体发生降解、融合、重组借以维持染色体的稳定性，调节细胞正常生长。端粒酶是自身携带模板的逆转录酶，由RNA和蛋白质组成。RNA组分中含有一段短的模板序列与端粒DNA的重复序列互补。而其蛋白质组分具有逆转录酶活性，以RNA为模板催化端粒DNA的合成，将其加到端粒的3′端，以维持端粒长度及功能。许多实验发现，肿瘤细胞的端粒酶活性是增高的，除造血干细胞外，正常细胞的端粒酶几乎没有活性。端粒酶可以在多个水平进行活性调控，其中包括hTR及hTERT基因的转录、mRNA剪接和成熟、转录后修饰，各组分的移位和定位等[5]。E6则是第一个被发现激活端粒酶的癌基因[6]，可直接通过刺激启动子，诱导和维持高水平的hTERT，阻断对p53抑制可导致端粒酶活性增高。从而使细胞赋有无限增殖的能力。

值得注意的是，E6还可通过其C-端PDZ基序(因最初发现于PSD95、DlgA和ZO-1这三个蛋白质而得名)与调控细胞连接形成和细胞粘附等相关的PDZ蛋白[5]相互作用，使细胞间粘附性降低从而失去接触性抑制，从而使癌细胞获得侵袭和转移的能力。Chen[6]等的研究结果显示：将HPV16的E6和E7基因转染入小鼠无侵袭转移能力的细胞后，可赋予细胞明显的侵袭和转移能力。

HPV16 E7在启动阶段(细胞失控性增殖和凋亡抑制发挥重要作用阶段)的作用强于E6，E7促使pRb蛋白进入泛素依赖途径，结合并降解pRb致使随后发生的一系列遗传事件发生改变，最终导致细胞的失控性增殖。

因此，HR-HPVs，特别是HPV16的两个病毒癌基因E6和E7持续表达不仅是引起感染细胞恶性转化、恶性表型维持及侵袭和转移的关键，而且为治疗性核酸(如反义核苷酸、核酶和siRNA等)治疗宫颈癌等HPVs相关肿瘤提供了理想靶点[7]。

3 反义寡聚脱氧核苷酸在治疗宫颈癌中的应用

3.1反义寡聚脱氧核苷酸(Antisense Oligodexynucleotides，AS-ODNs)基因技术特点 AS-ODNs基因技术是通过特定靶基因mRNA相互补的DNA序列片断，按照碱基互补原则，人工合成AS-ODNs与靶基因进行互补结合，从而阻断靶基因的表达和翻译，阻断病程进展达到治疗的目的。

AS-ODNs的最佳长度为16～20个碱基，既能与靶基因结合又能避免无意义的杂交。AS-ODNs是通过受体介导的细胞自吞饮作用进入细胞。目前已发现的蛋白受体有79KD，80KD，90KD的蛋白受体具有CD4家族基因特异性使AS-ODNs易于进入细胞。AS-ODNs应用在肿瘤中的作用机制是：(1)AS-ODNs可以有选择性和mRNA起始密码子AUG结合，与氨酰tRNA直接竞争结合位点，从而阻止核糖体阅读；(2)mRNA-DNA杂交链的形成，激活内源性核糖核酸酶RnaseH，使mRNA降解；(3)mRNA-DNA杂交直接抑制蛋白质的翻译；(4)AS-ODNs与mRNA前体hnRNA结合，抑制正常成熟hnRNA拼接；(5)AS-ODNs与双链DNA形成三股螺旋结构，可竞争抑制激活转录蛋白与基因启动子结合，从而干扰基因转录。

由于碱基互补原则使AS-ODNs具有高度靶特异性，从而设计容易、多样且合成简单，高度针对性的优点。

3.2AS-ODNs作用靶点 E6和E7中作为分子靶点不但为宫颈癌的治疗带来了新的手段，同样也为HPVs感染所致的其它肿瘤带来新的思路。有研究报道，应用设计覆盖HPV E6 E7全长的AS-RNA，通过质粒转染C4-1细胞，从成功而抑制抑制E6 E7表达。质粒介导的AS-RNA能够上调p53和释放细胞色素C到细胞质中致使蛋白酶9和3的激活，诱导细胞凋亡[8]。而以腺病毒作为载体将AS-RNA转入CaSki细胞中，使HPV16 E7蛋白表达减少，细胞周期停滞及RB蛋白表达增高，下调E2F和Bcl2，从而抑制CaSki细胞的增殖[9]。

因AS-ODNs其作用靶点序列定位准确、容易设计和合成，所以被认为是最具有潜力治疗肿瘤的药物，但是在实际应用中发现其用量大、抑制效率低及毒性大等特点，再加上成本过高又为临床应用带来了难题。随着现在生物技术的不断发展，RNA干扰(RNA interference)除了具有AS-ODNs相同的优点之外还具有专一性高、用量少、毒性小等特点，这些特点为临床应用带了新的广阔前景。

4 RNA干扰技术在治疗宫颈癌中的应用

4.1RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术特点 RNAi是已证实存在于线虫、植物、果蝇及哺乳动物中的具有基因敲除效应的dsRNA(double-stranded RNA)[10]。通过将与内源性mRNA互补的dsRNA导入细胞后，引起该mRNA特异性的降解，从而导致mRNA编码的基因不能表达，发生基因沉默。

RNAi现象最早要追溯到90年代，在1998年确定并命名。在1990年Napoli[11]等在设计将苯基乙烯酮合成酶基因转入矮牵牛属植物来提高色素产量时，发现转基因植物的花呈白色或杂色而不是原有的紫色这种效应是其内源性同源基因沉默或受抑制的结果，称之为共抑制(cosuppression)。在1995年，康奈尔大学的SuGuo教授[12]利用反义RNA技术研究秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)里的par-1基因功能时发现，par-1基因可与目的基因mRNA互补的反义RNA导入线虫细胞，使目的基因沉默(gene silencing)。之后将与mRNA序列相同的正义RNA导入细胞，出现相同的结果。在1998年Fire和Mello教授[13]首次应用秀丽新小杆线虫证明上述现象属于转录后水平的基因沉默，因此发现正义RNA抑制基因表达的现象，与过去的反义RNA技术对基因表达的阻断都是由于体外转录得到的RNA中污染了微量dsRNA而引起的。Fire教授将双链RNA(double-strand RNA, dsRNA)注入到秀丽新小杆线虫时却能够高效特异性阻断相应基因的表达，该小组将这一现象称为RNAi。

4.2RNAi 作用机制 RNAi是一个由dsRNA诱导的呈多步骤、多因素参与的复杂的过程。dsRNA由核酸内切酶Ⅲ(RNase Ⅲ)切割成21～23bp的siRNA，siRNA与内切酶、外切酶、螺旋酶结合最终形成RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)，RISC特异性地与目的mRNA同源区结合，通过酶的作用使mRNA降解，致使目的基因沉默。siRNA具有小分子质量、低浓度、低沉默信号即可在细胞间传递甚至传播至整个机体并可遗传等特点。需要注意的是，与AS-ODNs相同，siRNA具有较高的序列特异性。

4.3RNAi的应用 早先，用siRNA技术抑制HPV16 E6 E7的表达，以HPV 16 E6 E7 mRNA作为分子靶点特异性的沉默，发现E6沉默后p53蛋白表达增高，并且细胞周期调控基因p21活性增高从而使细胞增殖受到抑制，而E7沉默则直接导致细胞凋亡。在siRNA转染的HPV阴性的对照组细胞中，发现p53及p21无变化。由此表明，具有高效性及高度的特异性siRNA的沉默效应用于宫颈癌基因治疗是非常有价值的[14]。

此外通过siRNA的特异性沉默效应不但可以使靶基因失表达，同时还可以使失活的抑癌基因重新发挥生物学效应，促使细胞向正常方向进展[15]。未经修饰的siRNA则非常不稳定，在血清和细胞中很快被核酸酶降解，导致对靶基因的表达抑制只能持续数天或更短的时间[16]。当具有两个短反向重复序列及茎环(loop)组成的短发夹RNA(Short hairpin RNA，shRNA)，经介质入转到细胞后，通过RNA聚合酶Ⅲ的作用，可以在细胞内稳定表达。因此通过脂质体介导的外源性shRNA可以有高度特异性的持续表达从而沉默目标mRNA,达到基因沉默的目的。

4.4靶向RNA 设计 与AS-ODNs相同，当目的基因选定后，RNAi可根据碱基顺序排列设计与靶向mRNA互补的序列，应用所设计的序列进入细胞后按Watson-Crick碱基互补配对原则与靶向序列形成双链结构，然后通过后续机制影响靶基因的表达。因此，所设计的序列必须是可以与目的mRNA相互补的序列。通常是通过“semi-rational design”原则[17-18]，对目的序列先进行测序鉴定,选取含有AUG起始密码的区域开始，逐个寻找“AA”二连序列，标记其3’端碱基序列作为潜在的siRNA靶位点。因非编码区(untranslated regions,UTRs)含有丰富的调控蛋白结合区域，因此需要避开5’和3’端的UTRs[19]，通过将所选序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列同源的序列后选出合适的靶序列进行合成。

基于以上原则利用计算机分析可以减少对合适序列挑选的计算。然而由于体内微环境及蛋白、离子的作用，而使得所选定的序列不一定能正常地在体内发挥作用，因此对于靶序列的选择及序列的合成是一个较为复杂的过程。

4.5现状与展望 随着基因治疗手段的不断成熟，越来越多的基因靶点随被发现， 加上药物作用靶点的开发，基因功能的研究以极快的速度向前发展，各种研究基因功能的技术不断涌现，所以RNAi逐步成为一种强有力的工具，具有巨大的应用前景。RNAi的高效性、用量少、毒副作用小及序列特异性使它成在研究基因功能及基因治疗手段上占有极大的优势[20-22]。但又是由于高度的序列特异性使得RNAi在临床应用方面有些待解决的问题：(1)对靶点序列要求严格，1个碱基的错配都将大大降低目的基因表达的抑制作用；(2)通过载体和脂质体导入细胞内，因细胞来源的不同效果亦有所不同；(3)目前虽然已有研究利用RNAi技术在哺乳动物体内成功地抑制了某些特定基因的表达，但其方法尚不适合于人类。随着现在科技与医学发展的不断进步，RNAi研究的不断深入，所有困难均会迎刃而解，其应用范围也将会越来越广。在不久的将来，RNAi作为一种强有力的基因治疗手段应用于临床，在攻克人类疾病方面将会发挥其巨大的作用[23]。