胃食管反流病-Barrett食管-腺癌在表观遗传方面的研究进展*

牛 璐，邵 国， 孟宪梅，年媛媛

(1.包头医学院，内蒙古 包头 014060；2.包头医学院第二附属医院消化内科)

胃食管反流病(GERD)是一种常见并且多发的消化道疾病，并作为Barrett食管(BE)和食道腺癌(EAC)的重要危险因素。通常认为GERD-BE-EAC的发生与发展是环境因素与遗传相互作用的结果。随着对胃食管反流及相关疾病研究的不断深入，表观遗传学在胃食管反流病发生发展中的重要作用逐渐被认识，与之相关的表观遗传机制主要有甲基化和非编码RNA的调控。本综述讨论了有关GERD与BE和EAC之间可能的表观遗传重叠，这可能对探究胃食管反流病的发病原因和食管腺癌的早期防控有重要意义。

1 GERD-BE-EAC的发生和发展

胃食管反流病(GERD)是由环境和遗传因素共同作用的复杂疾病，主要症状是胃灼热和反酸，并且通常先于Barrett食管(BE)和食道腺癌(EAC)的发展。流行病学研究表明全球GERD患病率呈上升趋势，而EAC作为食管癌的主要类型之一，近年来发病率增高且生存率很低[1]。有学者使用LD评分回归方法估计GERD和BE之间的遗传相关性为77 %，GERD和EAC之间的遗传相关性为88 %。这项研究为GERD的多基因基础提供了第一个证据，并支持GERD和BE以及GERD和EAC之间的多基因重叠[2]。由于食管腺癌患者的发病率逐年上升且预后较差，对食管腺癌的早期病变Barrett食管和危险因素胃食管反流的研究对食管腺癌患者进行早期诊断和防治有重要意义。

BE是EAC的主要癌前病变，每年有0.12 %至0.5 %的BE患者发展为EAC[3]，而BE通常是在慢性胃食管反流(GERD)的背景下出现的。多项研究描述了与EAC相关的风险因素，大约80 %的EAC病例与吸烟史，胃食管反流病，中心性肥胖，低蔬菜水果饮食有关[4]。临床上，GERD除了表现出胃灼热和回流的症状也经常以非典型方式出现食管外症状，如胸痛、牙齿侵蚀、慢性咳嗽、喉炎或哮喘，严重影响患者的心理健康和日常生活。然而，目前还没有非常明确的原因来解释GERD的发展。

多年来，已发现GERD的发病机制中涉及若干环境因素。在胃食管反流病及其相关疾病中，存在化生-异型增生-癌的变化，上皮细胞内存在体细胞遗传和表观遗传变化的累积，这可能是决定癌症进展可能性的一个重要因素。表观遗传学(epigenetics)是一个新兴的研究领域，用于描述基因在不改变序列的情况下是如何与环境相互作用而产生特定表型，是可逆的并且可遗传的基因表达的变化。其主要内容包括DNA甲基化，非编码RNA调控和组蛋白修饰，染色质重塑等。而表观遗传修饰连接着环境因素与基因表达，提示其可能在GERD-BE-EAC中扮演重要角色。

2 与GERD-BE-EAC相关的表观遗传基因

2.1非编码RNA(ncRNA) 人类基因组大约70 %被转录为RNA, 而只有不到2 %编码蛋白质[5-7]。随着人们对人类基因组了解的增加，越来越多的证据表明基因组中的非编码部分在人类的正常生理和疾病中都有着不可或缺的作用[8-9]。在胃食管反流病-Barrett食管-腺癌过程中，ncRNA起到了重要作用。

2.1.1lncRNA lncRNA是一类不编码功能性蛋白的内源性RNA，其定位于细胞核和细胞质。lncRNA通常具有高度组织或细胞特异性，有可能成为肿瘤诊断的新型生物标志物和潜在的治疗靶点。Bartolomei于1991年发现了第一个长的非编码RNA(lncRNA)H19[10]。Okazaki等人在2002年，首次将lncRNA明确定义为长度大于200个核苷酸的转录本[11]。近年来，lncRNAs被证明在表观遗传调节和转录与转录后调节中扮演重要角色[12-13]，尤其在癌症中[14-15]。

AFAP1-AS1是人类癌症中的新型致癌性长非编码RNA，最初于2013年在食道腺癌中发现。AFAP1-AS1是在AFAP1编码基因位点反义链转录的上调的lncRNA，Wu等[16]报道AFAP1-AS1在Barrett食管、食管腺癌组织和食管腺癌组织细胞系中过度低甲基化和过表达，在BE和EAC中表现出明显的低甲基化，同时敲低它并不会明显改变EAC细胞中AFAP1的表达，但会通过诱导G2/M期停滞以及细胞生长和侵袭减少而导致增殖的减少，提示某些lncRNA可能通过表观遗传调控促进肿瘤的发生和发展而不是通过对邻近mRNA进行调控。推测AFAP1-AS1是在食道细胞中发挥功能性癌前作用的分子，它的过表达与低甲基化有关。

此外，已经证明了一些相关基因或信号通路参与了AFAP1-AS1的致癌功能，例如EMT相关基因和小的GTPase信号传导Rho/Rac通路，但其特定的上游和下游分子机制需要未来进一步的分析。功能实验表明，AFAP1-AS1可以促进肿瘤细胞的增殖，迁移和侵袭并抑制细胞凋亡。

在许多情况下，lncRNA通过调节邻近的编码基因的表达而起作用，但是仍然有例外。Yang等[17]证实了HNF1A-AS1在EAC组织和细胞系中异常上调，并可能在恶性肿瘤的发展中表现出辅助作用。敲低HNF1A-AS1不会显著改变HNF1A mRNA的表达。进一步的研究发现，响应HNF1A-AS1抑制，下游癌症相关的lncRNA H19的表达会明显降低。

另一个广受关注的lncRNA基因PVT1已成为多种肿瘤中的癌基因，实验表明与配对的Barrett食管组织和正常食管组织相比，食管腺癌组织中PVT1表达上调。PVT1的高表达与分化不良、淋巴结转移和生存期缩短有关。使用PVT1 反义寡核苷酸(ASOs)有效地敲除EAC细胞中的PVT1可导致细胞增殖、侵袭、集落形成、肿瘤球体形成和ALDH1A1+细胞比例降低。在机制上，EAC细胞中PVT1和YAP1相互调节。YAP1对PVT1有正调控作用。实验发现利用其特异性ASOs靶向PVT1和YAP1可在体内外产生更好的抗肿瘤活性。实验结果提供了强有力的证据，PVT1赋予食管腺癌一种侵袭性表型，并且是一种不良的预后指标。PVT1和YAP1联合靶向提供了最高的治疗指数，代表了一种新的治疗策略[18]。

但是目前还没有发现与AFAP1-AS1相关的miRNAs，并且关于癌症患者和健康人血液中的精确浓度和检测方法并不十分明确，这阻碍了lncRNA的临床应用。有关lncRNA的研究仍然处在一个早期阶段,其与蛋白、miRNAs、mRNAs、ceRNAs和其他lncRNA的关系值得进一步地探究和理解。

2.1.2microRNA MicroRNA(miRNA)是小(18～25个核苷酸)RNA，具有非蛋白质编码能力，可调节基因的表达[19]。miRNAs对人类约三分之一的基因起调节作用，其调节模式的异常可以引起GERD及其相关疾病的发生发展。miRNA通过刺激靶向信使RNA(mRNA)降解和抑制翻译在转录后水平发挥其调控作用。在多种疾病中，尤其是在恶性肿瘤中，已检测到miRNA的失调多项研究探索了BE和EAC中miRNA表达水平的变化[20-21]。

miRNA可通过与抑癌基因和转移抑制基因的结合促进癌症的发生发展。有研究发现MiR-21靶向抗癌基因和转移抑制基因，例如程序性细胞死亡4(PDCD4)、肿瘤抑制基因原肌球蛋白1(TPM1)、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)等，从而证明了其参与了癌症生长、侵袭和转移[22]。 重要的是，与鳞状食道上皮相比，BE和EAC中的miR-21表达上调。与癌旁组织相比，癌性EAC中miR-21过度表达(HR = 4.2， 95 %CI = 1.68-10.61)，表明它可能与多种组织学类型的食管肿瘤有关。但尚不清楚miR-21是通过外泌体途径从癌细胞中主动分泌还是通过细胞凋亡连续释放入循环。Maru等报道了EAC中miR-196a的表达增加和不典型增生。miR-196a的假定靶标包括HMGA家族成员和HOX基因(HOXD8，HOX C8，HOXA7和HOXB8)[23]。Luthra等发现针对膜联蛋白A1(ANXA1)的miR-196a在EAC组织中被上调，MiR-196a抑制ANXA1的表达，随后发挥抗凋亡作用并有助于EAC细胞存活。并进一步发现miR-196a是BE肿瘤发展的潜在生物标志物，并证明了BE-EAC转化过程中miR196a表达的逐步上调[24]。Maru等也发现miR-196a在EAC和BE中表达高于正常鳞状黏膜，并显示出抗凋亡和促进生长的功能。作者进一步证实，miR-196a通过基于miR-196a的模拟和荧光素酶报告基因检测可特异性靶向S100A9 3’UTR，SPRR2C和KRT5。因此miR-196a水平可能成为早期食管腺癌检测中的重要工具[25]。进一步确认miRNA的靶向基因对于了解该miRNA的详细生物学功能并确定其在EAC发展中的作用十分重要。

2.2甲基化 DNA甲基化是一种在胞嘧啶的CpG位点的碳-5位上加一个甲基的现象，CpG位点由一个胞嘧啶与鸟嘌呤相邻组成。这种表观遗传学改变被认为影响基因表达，因此可能是肿瘤发生的一个因素。在Barrett细胞中发现了许多抑癌基因、DNA修复和黏附分子基因的异常甲基化，如AKAP12、22、APC23 24和GPX3[26-27]。在它的发生过程中，还观察到抑癌基因(p16、APC、RUNX3、HPP1、TIMP3等)的启动子甲基化[28]。这样的研究已经阐明，启动子超甲基化通常是GERD-Barrett-EAC序列中的一种早期和进行性的异常表现,表明这些基因的差异甲基化有一定意义。与正常食管黏膜相比，BE和EAC都经常高度甲基化，尽管其水平是异质的。例如，CDKN2A启动子(p16INK4a)的超甲基化很常见，并与BE的肿瘤进展有关，并伴有9p21丢失，导致CDK2NA失活，这是有创EAC中的常见发现[26-27, 29]。Wu等[16]评估了BE和EAC中全基因组的低甲基化，尽管CpG的密度高，但低甲基化被证明是BE的主要表观遗传变化。另外,非编码区域中的变化比编码区域中的变化大。此外，较大的非编码区显示更多差异甲基化。有研究通过甲基化阵列分析了进行性增生与非进行性增生的Barrett食管患者组织，鉴定出了44种甲基化标记，它们可以区分发展为腺癌或保持静止状态的非增生性Barrett食管。并且对最近鉴定的肿瘤抑制因子OR3A4(探针cg09890332)的低甲基化已在一个单独的样本组中进行了验证， 发现两组之间的拷贝数没有差异，但是在进展组中观察到了偏向低甲基化的总体趋势。因此OR3A4的低甲基化可以对非增生性Barrett食管患者进行危险分层，并可能构成未来监测计划的基础[30]。

3 展望

随着GERD变得越来越普遍，以及癌症风险的增加，传统上BE患者定期接受内镜检查，如果没有其他异常发现，通常每2至3年进行一次。因此，患者一生中通常要接受多达10次或更多次的内窥镜检查，这就需要在GERD的管理中采用更加量身定制的方法。不同类型的表观遗传学分子机制通常并不单独在疾病中起作用，它们之间也存在协同作用。从表观遗传学的角度对疾病的发病原因进行探究，以在对患者的管理中进行危险分层，及时进行更加有针对性的干预措施。这将更有益于对GERD的病因的理解及GERD相关癌症的早期预防和治疗。