早期大肠癌主要基因诊断研究与进展*

葛淑敏，薛小慧，孔梦玉，崔 霞，叶晓宇，王长娟，武金宝

(1.内蒙古科技大学包头医学院2020级硕士研究生，内蒙古 包头 014060；2.内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院内蒙古消化病研究所)

大肠癌(Colorectal cancer，CRC，包括结肠癌和直肠癌)，属肠黏膜上皮恶性肿瘤。随着人们生活水平的提高，营养摄入丰富且过于精细，CRC的发病率整体是呈上升趋势[1]。据研究发现，在我国CRC已排在癌症致死因素和恶性肿瘤的第5位，且逐渐年轻化[2]。CRC患者寿命预期与其诊断密切相关，晚期CRC根治性切除术后5年的生存率小于5 %，而早期CRC可达90 %以上，大大提高患者的存活率[3-4]。因此，早期CRC的诊断也成为临床工作的迫切需要。早期CRC限于黏膜和黏膜下层，无淋巴结转移。这也表示初期并没有特异性的症状，很难引起患者防患意识，往往就诊时肿瘤已发展为中晚期，这无形中加重治疗和经济负担。CRC的早期诊断至关重要,尤其是对高危人群进行筛查。当前我国共识的高危人群包括：(1)大便隐血阳性者；(2)直系亲属大肠癌病史；(3)家族性腺瘤病史；(4)曾患其他癌症史；(5)精神、营养慢性腹泻及感染病史[3]。目前临床上常用的检测手段有：直肠指诊、大便潜血试验、内镜(电子结肠镜、纤维结肠镜，值得注意的是，扩大电子结肠镜和超声大肠镜不仅具备普通内镜优点，还可判断肿瘤对周围组织的侵袭及淋巴结转移，以便更加清楚地观察病变处[5])、脱落细胞学检查(简单易行，对于早期CRC意义重大)、早期CRC基因诊断等[6]。随着近些年来分子生物学的发展，逐渐揭开CRC是一种多基因多步骤发展性的肿瘤，抑癌基因的失活和原癌基因激活都会导致其编码的蛋白发生结构改变，进而影响其生物活性[7]。测定CRC密切联系的P53、DCC、APC、RAS家族等基因有助于早期CRC的诊断。研究早期CRC基因诊断是为了寻找具有敏感性和特异性强的肿瘤标志物，尤其是家族性遗传CRC，早期诊断早期治疗，是解决问题之根本。本文简介早期CRC主要基因诊断进展。

1 P53 基因

1.1P53基因的结构和功能 人类P53基因位于17号染色体(17P13.1)，属人体重要抑癌基因，也称为基因组卫士[8]，由10个内含子和11个外显子构成，主要存在细胞核内，其主要分型为野生型(Wt-P53)和突变型(Mt-P53)。20世纪70年代首次发现，四十年间对其研究不断加深。目前认为Wt-P53编码的蛋白质是一种转录因子，控制和监测正常细胞的周期。P53的转录机制是通过P1启动子和P2启动子控制的。P1位于第一外显子的上游，P2位于第一内含子上，P1结合位点包括AP1相关蛋白及NF1蛋白，需要内含子进行正调节，而Wt-P53之所以会被称为抑癌基因，通过抑制细胞增殖，致使细胞凋亡[9-13]。目前还发现P53基因会与一些病毒和细胞蛋白结合形成新的复合物[14]。Green[15]通过实验表明突变后P53会抑制野生型P53，与其竞争与底物结合，致细胞周期异常和癌化发展。Scheffner等学者[16]发现，人HPV病毒E6蛋白与P53结合后，致使wtP53迅速溶解，并且还能通过阻断SV 40 T抗原与DNA聚合酶a结合，从而抑制SV DNA的复制，这也说明P53可能还作用于某些细胞内靶蛋白，从而起抑制作用，进而阐述P53可能对细胞生长是抑制作用。P53基因在细胞中的作用复杂且多样，尤其突变后，很多机制仍不明确，随着分子生物学发展，P53也会成为肿瘤治疗和早期诊断的重要靶点。

1.2P53基因与CRC P53通过突变和点缺失、过度表达在上皮细胞。抑癌基因P53的突变多种多样，mtP53主要是与wtP53竞争并抑制其活性，加快肿瘤细胞的生长。据研究发现Mt-P53在大肠癌中检测率可为50 %，可用于CRC早期诊断、分级、分期及预后判断。詹义凤[17]主要应用免疫组化的方法检测正常肠组织、大肠低分化腺瘤、大肠高分化腺瘤及大肠癌组织中Mt-P53的表达率，其呈现逐渐上升趋势，各组阳性表达有显著差异(P<0.05)，在大肠癌前病变和早期大肠癌阶段，Mt-P53高表达，常提示患者的病变处于进展期。P53的突变和过度表达可以作为临床早期腺瘤良恶性的鉴别手段。同时陈康部[18]通过对大肠癌、大肠腺瘤和正常大肠组织中的Mt-P53进行检测，分别为74.00 %、62.00 %、0，阳性表达率明显减少(P<0.05)，说明P53在大肠早期发生癌变时会发生正相关的升高，并且P53还与浸润深度、分化及分期相关，T2、T3和T4的P53表达率高于T1(P< 0.05)，Dukes分期越高P53的表达率越高。根据不同学者的研究均发现，P53的表达在大肠癌患者体内，癌变越严重值越高，并且浸润深度和分期密切相关[19]。说明P53在大肠癌发生和发展起到重要作用，通过检测P53的表达率，早期发现腺瘤或者溃疡有癌变倾向，进行临床治疗可以大大减轻患者负担和痛苦。郑艳清等[20]收集149散发性结直肠癌标本与149份正常大肠组织对照组，采用对大肠癌组织标本进行微卫星不稳定(MSI)检测和免疫组化后，结果显示癌组标本Mt-P53蛋白的表达率可达67.1 %，高于正常组，因此可通过检测P53了解结直肠癌的预后效果、恶化程度及治疗，并发现错配修复(MMR)引起的基因异常。微卫星不稳定可为结直肠新机制提供很多新的研究方向。P53的研究意义和临床价值会为早期CRC患者会带来重大福音，同时为分子水平的靶向治疗提供新思路。

2 APC基因

2.1APC基因的结构和功能 APC(腺瘤性结肠息肉病)基因是1986年Herrera发现的一种可以抑制肿瘤的基因，其与肠息肉病有关[21]。Gtoden等人首次在结肠癌中分离并克隆出并给予命名。Shpitz[22]采用特异性DNA探针及PCR技术分离出APC位于染色体5q21-q22，8 538个核苷酸组成，可以编码2 843个氨基酸，共有15个外显子，第15号外显子体积最大(约占81.3 %)、功能也是最复杂的[23]。APC基因编码的蛋白质成为APC蛋白，主要存在细胞膜和胞质内，最重要的功能就是直接参与Wnt/β-catenin信号转导途径(激活核内靶分子)。APC蛋白与GsK-3B、Axin等形成复合物来保证Wnt信号途径对细胞特化、增值、极性以及迁移的正常调节[23-24]。APC基因一旦发生变异，上述复合物不会形成，最终会导致Wnt/β-catenin通路保持激活状态，β-catenin无法代谢聚集在胞质内，进而细胞无节制增生，启动大肠腺瘤细胞增殖及癌变[23、25-26]。Fodde等[27]建立敲掉部分ACP基因的老鼠模型，给予刺激因素，发现结直肠未见腺瘤产生。APC基因的突变可以在任何区域，变异后编码的蛋白不同，表现在大肠上的腺瘤形态也不同，主要集中在第15号外显子的5’ 段MCR区域，国内外学者报道MCR区域的突变率在28 %～48.8 %左右[28-29]。APC基因突变常见于家族性腺瘤性息肉病(FAP)，是常染色体显性遗传病，家族基因一旦携带变异性APC基因，发病率极高，常以多发出现。

2.2APC基因与CRC 大多数的癌前病变都与APC基因的变异表达和缺失有关，属于CRC最早期表现，首先发现在FAP，后发现在散发的CRC中也起到很大的作用[30]。APC突变形式包括移码突变和点突变，前者编码出无效的截短APC蛋白[31]。杨春等[32]收集已确诊为大肠腺瘤(排除家族性)、大肠癌和正常组织组织标本，采用蛋白截短检测方法，结果显示，APC蛋白截短分别为42.86 %、47.06 %和0，正常组织与大肠腺瘤、CRC有明显差异(P=0.001)，管状腺瘤明显高于绒毛腺瘤和混合腺瘤(P<0.05)，提示变异性APC在大肠的内皮发生瘤变出现，即由腺瘤发展为癌的过程中也是一直存在，APC蛋白的截短可以作为诊断早期CRC的标准。相关学者也发现APC蛋白的截短还与腺瘤的分型有指导作用[33]。赵龙等[34]分析了120例大肠癌术后标本，采用二代测序技术检测APC基因在16号外显子的突变，结果显示，在肝转移的患者APC的变异率高于非肝转移者(χ2=5. 789,P=0.016)，处于T4突变率明显高于非T 4期患者(χ2=4. 144,P= 0. 042 )。刘志贞等[35]研究早期诊断腺瘤和CRC时，通过粪便检测APC基因发现，两者中APC基因存在较大差距。粪便检测APC基因操作简单便捷，可适用于早期CRC的诊断。现在多种不同的研究显示，通过早期基因检测大肠癌细胞缺乏正常APC蛋白，治疗过程中添加APC蛋白可对肿瘤细胞的生长起到抑制的作用，未来研究找到相关靶点及敏感的肿瘤标志物，可在分子生物学角度对大肠癌早诊断早治疗。

3 DCC基因

3.1DCC基因的结构与功能 DCC基因于20世纪由Fearon等[36]对大肠癌组织定位克隆发现并确认的，位于染色体18q21.3，全长370 kb。DCC基因编码的蛋白属于跨膜蛋白，其外部的细胞粘附分子和氨基酸序列与其它相关的细胞表面的糖蛋白的氨基酸序列高度同源，也就具有类细胞粘附作用，通过在胚胎发育分化和介导细胞间、细胞与间质间的相互作用，进而影响细胞的生长、分化和信息传递，如果DCC基因缺失会导致细胞分化异常，细胞向瘤化生长[37-38]。 Keino-Masu等[39]发现DCC蛋白可能还介导神经轴突发育的Netrin-1部分受体，该受体大多数正常上皮都可以表达，但是一旦上皮组织发生癌变倾向，表达会明显减少。目前共识DCC减少主要是由于基因丢失和启动子甲基化。姜洪伟等[40]检测大肠癌DCC基因启动子甲基化状态发现，甲基化频率与肿瘤组织分化程度、分期密切相关(P< 0.05)。DCC基因在细胞内的功能还有很多机制不明，与众多器官组织的癌变相关，研究发现DCC基因表达缺失还与胃癌[41]、子宫内膜癌[42]、卵巢癌[43]等相关，可以作为生物学标志物来诊断早期癌变的发生。

3.2DCC基因与CRC 作为人体最大的抑癌基因，DCC基因在正常情况下对我们的大肠起到保护作用。张慧晶[44]等发现，组织、不典型增生组织、炎性组织及癌旁正常组织DCC的表达逐渐升高，即癌组织中DCC蛋白明显少于正常组织，这种失表达可能推进早期CRC的发生。同时张慧等[45]通过对比60例CRC及其癌旁正常组织，结果显示，DCC蛋白在癌组织中的表达为20.0 %，癌旁正常组织为96.7 %，两者对比差异十分明显(P<0.05)，说明DCC基因的缺失表达与CRC的出现是正相关的。多位学者研究均发现，DCC基因发生改变是CRC早期事件，也是一个重要的促发因素。DCC基因的失活主要是因为等位丢失，所编码出的变异DCC蛋白刺激CRC分化和分期等，与APC相同的是，它的变异后编码产物也是伴随整个CRC阶段。套格苏等[46]采用PCDNA3.1(+)- DCC重组质粒转染到大肠癌裸鼠上，结果显示DCC蛋白含量降低，并且癌组织中的淋巴管减少和瘤重少有减轻，说明DCC基因通过诱导细胞凋亡并且抑制癌细胞的生长增殖，这与国外学者Castes等[47]研究发现一致，DCC可以作为肿瘤生长的抑制剂，诱导癌细胞凋亡。李圆圆等[48]研究发现APC基因的变异发生在瘤变初形成阶段，DCC基因的变异是在瘤变中期向晚期发展的阶段，略晚于APC，证实了CRC早期是个多基因介导的疾病。

4 K-RAS基因

4.1K-RAS基因的结构与功能 RAS基因家族包括K-Ras、N-Ras和H-Ras，作用广泛，人体内大多数细胞都可以表达[49]。K-Ras位于常染色体12q12.1，含有4个编码外显子和1个5’端非编码外显子，共同编码含189个氨基酸的RAS蛋白，也称为p21蛋白[49-50]。K-Ras蛋白是由膜结合型的三磷酸鸟苷(GTP)/二磷酸鸟苷(GDP)结合后的蛋白，简单来说就是GTP酶，将GTP转化为GDP，当Ras蛋白受到影响某些影响细胞发育和成熟的因子诱导后激活，会把细胞膜表面的表皮生长因子(ECFR)和一些激素递质传递到细胞核，而后迅速失活，传递停止[49]。K-Ras蛋白参与的最重要通路就是RAS-MAPK，作用机制复杂。国内外有很多学者研究这一通路，目前公认该通路主要传递信息，参与细胞整个发育阶段包括凋亡[49，51]。上述的K-Ras的功能是野生型K-Ras，K-Ras基因发生突变或过度表达后K-Ras蛋白的功能紊乱，会导致细胞异常生长，出现癌变倾向，成为CRC的致癌基因，亚洲人突变的率为29 %-62.9 %[52]。有部分学者认为K-Ras本就是原癌基因，在大肠癌中其突变后表达率和野生型差不多[53]。突变型K-Ras主要是在外显子23和4。周楠[54]通过87例结直肠癌患者组织，进行基因检测，发现尤其是2号外显子第12、13密码子突变最常见。突变型的K-Ras可以持续激活RAS- MAPK通路，促进肿瘤细胞无限增长，影响CRC分化[55]。

4.2K-RAS基因与CRC 在CRC初始阶段是最常见的原癌基因改变K-RAS基因的突变，在大肠癌的发生、发展过程中起到启动和促进作用[56]。詹俊[57]等收集31例大肠癌、26例大肠腺瘤和27例正常对照组患者的粪便和血液进行DNA的提取，后PCR扩增，结果显示，粪便K-Ras基因突变在大肠癌、腺瘤和正常对照组分别为54.8 %、7.7 %、0 %，大肠癌标本远高于正常的标本(P<0.05)，血液中分别为48.4 %、3.8 %、0 %，血液中大肠癌组也是高于正常的标本(P<0.05)，即K-Ras基因突变主要发生在大肠癌时期，特异性也比较高，血液和粪便联合监测可作为早期CRC无创的筛查方法。马其钊等[58]研究发现K-Ras基因突变与CRC的分化程度相关，与浸润深度、淋巴转移无关，表明K-Ras的突变也是属于大肠癌的早期癌变因素。韦汝珍[59]对375例大肠癌患者进行K-Ras变异率的基因检测，目的是做出基因诊断和靶向治疗。西妥昔单抗治疗野生型K-Ras基因大肠癌患者敏感，而对突变型无效反而增加药物的毒性，说明K-Ras基因不仅可以用于早期CRC诊断，而且还可以用于中、晚期CRC辅助治疗。

5 小结与展望

目前诊断早期大肠癌的方法众多，但是总体检出率并不高，大都是疾病已经发展到一定的阶段，有明显的临床表现后才能得到诊断和治疗，无形中增加了患者和国家的负担。随着分子生物学的发展，对大肠癌发病机制及致病基因不断研究认识，可以通过基因检测辅助内镜增加检出率或是发现敏感的早期大肠癌肿瘤标志物等。在组织发生癌变倾向时，会有基因方面的改变，这为基因研究提供理论依据[60]。还有很多基因的致病机制及突变的靶点仍在探索中。研究早期大肠癌的基因诊断是十分有必要的，一方面可以提高检出率，另一方面发现个体化的靶向治疗。