环状RNA在部分家畜生长发育调控方面的研究进展

杨青林，张艺鸣，张砚池 ，张燕军,2,3,4*

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.农业农村部肉羊遗传育种重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018；3.内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018；4.内蒙古自治区山羊遗传育种工程技术研究中心，内蒙古 呼和浩特 010018）

1 引言

circRNA是一类特殊的非编码RNA分子，与传统的线性 RNA （linear RNA，含 5′和 3′末端）不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。广泛存在于多种生物细胞中，具有结构稳定、序列保守及细胞或组织特异性表达等特征［1］。这种RNA的发展历程十分艰辛。circRNA最早发现于20世纪70年代。1976年，人们利用电镜等技术在植物感染的类病毒 (Viroids)及副流感病毒(Sendaivirus)颗粒中首次观察到circRNA。之后，研究人员又在动物细胞和真菌酵母中发现了circRNA，但是由于生物技术的局限性和结构的特殊性，circRNA在当时被认为是错误剪接或剪接过程中形成的副产物,并定义为没有研究意义。随着21世纪的到来，RNA-seq技术和应用的快速发展，使研究者加深了对非编码RNA世界的印象，一类广泛存在于多种生物细胞中并具有多种调控作用的新型内源性非编码RNA-circRNA逐渐受到人们的关注。

circRNA有以下五个生物学功能：（1）与典型剪接发生竞争[2]；（2）充当 miRNA 分子的“海绵”[3]；（3）调控基因的转录[4-5]；（4）与蛋白质结合，调控蛋白活性[6]；（5）翻译为蛋白质[7]。目前，circRNA研究主要集中在人体疾病，比如癌症、肿瘤等医学方面。近年来，对各种家畜的研究也逐渐增多，主要集中在circRNA的信息挖掘，关于其作用机理的研究也在慢慢深入。同时,circRNA的更多生物学功能亦有待进一步探索。本文综述了circRNA在部分家畜生长发育中的调控作用，以期为研究家畜组织中circRNA的功能提供理论依据与研究思路。

2 circRNA在羊生长发育调控方面的研究

circRNA参与了羊胚胎、脑垂体、肌肉和骨骼肌等组织器官的生长发育调控。在这个过程中，circRNA主要通过充当miRNA的海绵来发挥调控作用，从而影响各种组织的生长发育。

2.1 circRNA在胚胎方面的研究

在细胞发育过程中，circRNA在细胞增殖、分化、自噬和凋亡等方面发挥着重要作用。La Y等[8]发现，在粗毛羊和细毛羊的卵泡期和黄体期分别有147个和364个差异表达的circRNAs。这些来源基因主要涉及与生殖和能量代谢有关的雌激素信号通路、转化生长因子β信号通路、促性腺激素释放激素信号通路、催产素信号通路、磷酸戊糖途径、淀粉和蔗糖代谢等。

Liu等[9]以汉珀羊为研究对象，发现183个circRNAs在卵泡期单胎绵羊和卵泡期多胎绵羊中存在差异表达。黄体期单胎绵羊与黄体期多胎绵羊中有34个circRNA差异表达。这些功能通过EGF-EGFR-RASJNK、tgf-β和甲状腺激素信号通路影响汉珀羊的产羔数。 Tao等[10]在波尔山羊和麻城黑山羊中，共检测到37个circRNAs基因的差异表达。发现Chi-circ-0008219参与了一个巨大的circRNA-miRNA-mRNA共表达网络；且通过荧光素酶活性测定，观察了Chicirc-0008219对3种卵泡相关miRNAs的吸附作用。综上所述，这些研究结果表明，circRNA对绵羊胚胎发育具有潜在的影响，而这将决定羊的经济效益。

2.2 circRNA在脑垂体方面的研究

垂体腺是动物最重要的内分泌器官，主要通过调节激素的合成来调节动物的发情。Li X等[11]在绵羊发情期和乏情期脑垂体系统中共鉴定了12468个和9231个差异表达的circRNAs，并证实了部分差异表达的circRNA。丰富了涉及发情相关术语和通路调控的circRNA。Li等[12]通过对产前和产后绵羊脑垂体中RNA-seq数据的鉴定，发现了10226个circRNAs。他们的研究结果表明，绵羊circRNA对RNaser消化具有抗性，并在出生前后的垂体腺中表达。差异表达的circRNA的宿主基因参与了激素分泌的调节以及与这些过程相关的几个途径。确定了许多circRNA和参与脑垂体生物功能的脑垂体特异性miRNA的相互作用。

2.3 circRNA在肌肉方面的研究

Li等人[13]在胚胎和成年绵羊背最长肌肉中成功地识别了6113个circRNAs。在研究中筛选出了绵羊出生前后肌肉组织中差异表达的circRNA，发现了一些circRNA参与了肌肉生长发育的调节。此外，他们在这次的研究中意外地发现了一些circRNA，同时包含不同miRNA的多个靶位点。Cao等人[14]发现，许多circRNAs与肌肉特异性miRNA相互作用，circRNA的承载基因与肌肉细胞发育和信号通路有关。赵薇博士[15]在山羊背最长肌的6个发育时期共鉴定出14655个circRNAs。其中有6276个circRNAs在6个发育阶段共表达，共有1336个circRNAs的表达量在不同发育阶段两两之间存在显著差异。此外还发现，circRNA与miRNA的结合呈现“多对多”的关系且结合位点数在circRNA中呈现不均等分布。这些研究结果说明，肌肉的生长发育受到circRNA的影响。

2.4 circRNA在骨骼肌方面的研究

石田培等[16]通过研究首次获得绵羊胚胎骨骼肌发育的全转录组图谱，并找到快慢肌转换的关键转录物circRNA7527以及与肌细胞增殖分化相关的核心转录因子circRNA17939、circRNA2324和circRNA19073等。Ying等[17]首次揭示了山羊骨骼肌中circRNA时序动态表达模式，发现多个基因都产生了不同circRNA亚型，表明circRNA具有多样性及其调控机制的复杂性。他们在这里首次通过RNA-seq描述了山羊骨骼肌7个发育阶段中的circRNA表达谱，并描述了SDECs的时间模式。聂露等[18]发现，circCDR1as在胚胎发育中期骨骼肌中呈现极显著的高表达，并且发现CDR1as与miR-7有70个保守的结合位点。CDR1as过表达可以抑制miR-7mimics对SMSCs的分化，说明CDR1as可能通过竞争性结合miR-7,阻碍IGF1R下调来促进SMSCs分化。CaoYang等[19]从绵羊骨骼肌中鉴定了886个circRNA，提供了绵羊骨骼肌中circRNA的全面表达谱。

3 circRNA在牛生长发育调控方面的研究

circRNA参与了牛胚胎、大脑组织、肌肉、脂肪和乳腺等方面的生长发育调控。主要以参与各种信号通路和抑制或干扰基因表达来调控各组织的生长发育。

3.1 circRNA在胚胎方面的研究

Gao Y等人[20]在秦川牛新生期和成年期睾丸中检测到了21753个circRNAs。并进一步研究了牛睾丸circRNA的基因组特征、长度分布及其他特征。王晶晶等[21]以青年母牛为研究材料获得牛体内囊胚约887个circRNAs，并且以CLASSIC为主要类型。而这种剪切方式会形成成环的外显子circRNA。 Su X等人[22]的研究表明，异常的circRNA表达可能在胎盘结构和功能障碍中起多种作用。

3.2 circRNA在大脑组织方面的研究

郑磊等[23]在西藏牛和三江牛大脑组织中低氧适应相关circRNA的研究中共筛选了差异显著的858个circRNAs。所筛选出的858个circRNAs主要与MAPK信号通路、谷氨酸能突触、Rap1信号通路、磷脂酶D信号通路以及cGMP-PKG信号通路等有关。

3.3 circRNA在肌肉方面的研究

魏雪锋等[24]在秦川牛90天胎牛和24月龄成年牛肌肉中得到了12981个候选circRNAs，并发现circRNA42在肌肉发育过程中下调程度最大，暗示其在肌肉发育中可能具有重要功能。表明circLMO7有能够促进肌细胞增殖和抑制肌细胞分化和肌管产生的功能。与此同时，Wei等[25]进一步研究表明，过度表达的circLMO7，抑制了牛原代成肌细胞的分化，其参与牛的肌肉发育，可增加细胞周期s期成肌细胞的数量，降低G0/G1期细胞比例，促进成肌细胞增殖，保护成肌细胞。 Li等[26-27]分析了秦川牛胚胎时期和成年时期牛肌肉组织中差异表达的circFGFR4、circFUT10。通过试验观察到circFGFR4能吸附miRNA-107，circFGFR4的过度表达增加了Wnt3a的表达，而这种效应被miRNA-107所消除。表示circFUT10、circFGFR4的表达在肌肉组织中的调节可能成为控制牛肌肉发育的繁殖策略中的潜在目标。Xiao等人[28-29]通过秦川牛胚胎时期和成年牛肌肉组织中差异表达的circRNA-circTTN研究发现，过表达的circTTN能够促进牛成肌细胞的增殖及分化，相反，干扰circTTN抑制了牛成肌细胞的增殖及分化。

Huang等人[30]研究了造成牛与水牛肌肉品质差异的circRNA分子调控机制，他们共检测到10449个circRNAs候选基因，其中1128个在牛和水牛肌肉组织库中有差异表达。经过体内研究表明，新的调节因子circEch1能够诱导成肌细胞分化和骨骼肌再生。

3.4 circRNA在脂肪方面的研究

蒋瑞等[31]对秦川牛不同发育时期脂肪组织中circRNA的表达分析表明，在犊牛和成年牛中共检测到14274个circRNAs。通过进一步研究发现，circFUT10促进牛脂肪细胞增殖和抑制牛脂肪细胞分化，也通过吸附let-7c来促进脂肪细胞增殖,抑制其分化，进而调控秦川牛脂肪细胞的增殖和分化。Yongfeng等人[32]在牦牛脂肪细胞分化过程中首次确定了circRNA的表达模式。他们检测到7203个circRNAs候选基因在脂肪细胞分化后第12天有136个circRNAs差异表达，第0天有7个circRNAs差异表达，并且发现了6个与脂肪细胞分化相关的circRNA。

3.5 circRNA在乳腺方面的研究

Chun等[33]研究产后90、250天的奶牛乳腺组织中差异表达的circRNA，发现circRNA包含许多miR-2284家族结合位点，可以作为miR-2284海绵调节酪蛋白的翻译。 YanHong等[34]从牛奶外泌体中鉴定出2059个不同的circRNAs，其中大多数在初乳或成熟牛奶外泌体中表达，且图谱差异很大。由于牛奶外泌体中的RNA可以被吸收并在接收细胞中发挥作用，这些RNA可能作为一种新的调节营养物质供婴幼儿和成年消费者使用。

4 circRNA在猪生长发育调控方面的研究

circRNA参与了猪脑部、染色体、繁殖器官、肝脏、心肌、骨骼肌和肌肉等组织器官的生长发育。主要以吸附miRNA或参与各种组织器官有关生长发育的网络构建来起到影响作用。

4.1 circRNA在脑部表达方面的研究

Veno等[35]做了大型动物大脑发育中第一个circRNA报告，共挖取了4634个circRNAs。他们发现在胚胎时期第60 d circRNA的表达量显著高于第80 d时的表达量，且具有显著的时空表达特征。陈建宁等人[36]发现，猪脑组织ceRNA共表达网络中包含54个与年龄相关的circRNA。说明这些circRNA在猪胚胎大脑发育的生物学过程中发挥着重要调控功能。

4.2 circRNA在染色体方面的研究

李巧伟等人[37]在长白猪、通城猪和五指山猪16个发育阶段和9种不同组织上共鉴定了8486条circRNAs。通过对circRNA的系统鉴定与分析，发现91%的circRNA属于外显子型，5%的circRNA属于内含子型，仅4%的circRNA属于基因间型。这些circRNA主要分布在1、6和13号染色体，平均长度为350 nt。马继登等[38]对猪背最长肌和腰大肌进行转录组测序后表明，在6个测序文库中共鉴定出56个circRNAs。其中30个（57.57%）来源于未整合到染色体上的猪Scaffold序列，6个（10.71%）来源于猪13号染色体，14个 （25.00%）来源于猪14号染色体，3个（5.36%）来源于猪15号染色体，2个（3.57%）来源于猪18号染色体，1个（1.79%）来源于猪X染色体。

4.3 circRNA在繁殖器官方面的研究

王月莺等[39]以大白猪的初产母猪为研究对象，在大白猪子宫内膜中得到了28055个circRNAs。筛选得到差异的circRNA富集的生物学功能主要是参与粘附、钙离子通道活性和免疫调控等。郭天亚等[40-41]以猪卵巢卵泡和卵泡颗粒细胞为研究对象，经过分析发现，circRNA通过miRNA在转录后调控基因表达中起作用且在猪卵巢卵泡闭锁过程中特异性表达并具有潜在的生物学功能。在猪颗粒细胞中,circINHA通过竞争性结合miR-10a-5p，上调CTGF表达来抑制颗粒细胞的凋亡。Cao等[42]在几个物种的卵丘细胞和卵母细胞中鉴定了637个circRNAs。他们发现通过微量注射siRNA将母体circARMC4基因敲除会导致染色体排列严重受损，并显著抑制第一极体的挤出和早期胚胎的发育。这些结果首次表明，circRNA在卵丘细胞和卵母细胞中以发育阶段特异的方式大量动态表达，并且母系表达的circARMC4对猪卵母细胞减数分裂成熟和早期胚胎发育至关重要。谢苏等人[43-45]先后鉴定了梅山猪及杜洛克猪circ0015292、circ0001651和circ0010513在卵泡中的表达研究。发现这三个circRNA通过靶标基因参与细胞周期、细胞增殖凋亡及卵巢发育等相关信号通路,提示其可能通过对靶基因的调控作用间接参与卵泡发育过程。

4.4 circRNA在肝脏方面的研究

巩慧颖等[46]在二花脸猪和大白猪肝脏差异性circRNA功能预测分析试验中发现,猪肝脏胆固醇代谢相关基因的差异表达可能与circRNA的调控有关。他们还发现，circRNA-ETFA吸附miRNA从而减弱miRNA对HMGCR的靶向抑制作用，添加HMB后,显著增加了肝脏中HMGCR的蛋白表达及胆固醇的含量。陈建宁等人[36]发现，猪肝脏组织ceRNA共表达网络中包含13个与年龄相关的circRNA。靳艺等[47]以陆川猪和杜洛克猪的肝脏、脂肪和肌肉组织样品进行mRNA和circRNA的测序和分析发现，在陆川猪和杜洛克猪肝脏组织中筛选出1714个差异表达基因和190个差异表达circRNAs。

4.5 circRNA在心肌和骨骼肌方面的研究

陈建宁等人[36]发现猪心肌组织ceRNA共表达网络中包含4个与年龄相关的circRNAs。猪骨骼肌组织ceRNA共表达网络中包含17个与年龄相关的circRNAs。Chen[48]在心肌和骨骼肌衰老差异表达试验中发现，心肌衰老过程中有26个circRNAs差异表达,骨骼肌衰老过程中有62个circRNAs差异表达，且心肌和骨骼肌的衰老过程有着根本的不同。之后他们构建了肌肉衰老过程中circRNA-miRNA-mRNA共表达网络。Jing等[49]对淮南猪和杜洛克相互比较中发现，有66个差异显著的circRNAs。其参与MYOD1、PPARD、miR-423-5p和miR-874这些与骨骼肌肉增殖、分化/再生和脂肪增生有关的网络构建。曹海港等[50]以猪背最长肌和比目鱼肌为研究材料，通过比对分析鉴定出26015和25130个circRNAs，其中10388个在两种肌肉中共表达。进一步研究后筛选出调控猪肌纤维类型的关键circRNA，发现并验证了circMYLK4能促进猪慢肌纤维的发育和抑制猪骨骼肌卫星细胞的分化功能。

4.6 circRNA在肌肉方面的研究

靳艺等[47]在肌肉组织中筛选出1367个差异表达基因和258个差异表达circRNAs。在脂肪组织中筛选出2173个差异表达基因和110个差异表达circRNAs。李媛等[51]对大白猪和莱芜猪肌内脂肪组织中 circRNA的表达进行鉴定发现，sscirc002807、sscirc009352靶基因富集于胆固醇平衡和磷脂平衡等与脂代谢相关的生物学过程中。

5 展望

环状RNA作为新一代研究方向的“明星”已经从诸多不同物种和组织中鉴定出来，但是它们在生物学过程中的调节功能各不相同。它们已显然不是那个被认为是非正常剪接出来的副产物了，其在生物发展以及调控功能上的贡献不容小觑。

目前，众多研究学者对环状RNA的未知功能进行了大量的相关试验研究并发表了文章。弥补了人们对环状RNA的不了解性，激发了人们对环状RNA的研究兴趣，引起了探索环状RNA的热潮。但这股潮流起步相对较晚，研究时间短，所以对环状RNA的研究并不鞭辟向里。研究者还需要对待定物种进行基因组测序，提高转录组数据分析水平以及采用试验手段找到和鉴定更多的circRNA并探究其发挥功能的分子机制，进一步挖掘其与经济性状相关的生物学功能和调控机制，为家畜育种提供理论依据。