动物细胞在疾病治疗和诊断中的应用

李晓奇，王凤武，韩健健

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010021；2.通辽市动物疫病预防控制中心，内蒙古 通辽 028000）

动物细胞拥有大量的传感和调节蛋白，用于维持细胞内部状态的稳定。其中，跨膜受体蛋白持续监测细胞外环境，将特定的细胞外信号转导为细胞内反应。配体蛋白与其同源受体的结合触发细胞内信号级联反应，最终诱导转录变化。研究人员一直在利用动物细胞的传感蛋白及其生物合成能力构建回路，用于基于细胞的诊断和治疗方式上。动物细胞常用作回路改造的载体，以创建能够直接与人类疾病信号相关的细胞模型。

大多数可编辑的调控回路均源于转录因子 (TFs)调节的网络。早期动物细胞回路主要由来自细菌或酵母（例如TetR或GAL4）的TFs与转录激活或抑制域（例如VP16或KRAB）融合而成。然而，近年来内源性TFs，如活化 T细胞的核因子(NFAT)、cAMP反应元件结合(CREB)、活化B细胞的核因子kappa-轻链增强子(NF-kB)以及信号激活剂转录(STAT)由上游天然或嵌合受体及其信号级联激活，已被广泛用于调控回路的条件表达。此外，可编程DNA结合域成为技术发展的重点领域，例如成簇的规则间隔短回文重复序列(Crispr)/Cas系统[1]。这些都极大地促进了针对内源性基因调控的编辑回路的研究。

1 动物细胞可溶性分子的传感响应回路的研究进展

构建感知和响应病理水平可溶性回路的最简单的方法是使天然配体与受体相互作用并重新连接相应的信号级联以执行特定的响应。例如，分别过表达组胺HRH2受体或胆汁酸TGR5受体已被用于改造动物细胞以感知与过敏相关的组胺水平或与肝功能受损相关的高水平胆汁酸[2,3]。这两种过表达受体都使用cAMP信号通路，该通路被重新连接以激活所需的转录输出。此外，离子通道也被探索作为介质为细胞提供新的感觉功能。例如，过度表达电压门控钙通道的HEK细胞可以触发天然钙信号和NFAT转录因子的激活，以响应高葡萄糖水平；使用NFAT响应启动子，可以获得高血糖诱导的转基因表达[4]。

另一类编辑传感器和响应回路依赖于蛋白酶的信号转导模块。所谓的Tango受体系由天然受体组成，这些受体通过含有蛋白酶切割位点的柔性接头在细胞内与合成TF（例如tTA）融合[5]。配体与其受体的结合会募集一种与目标蛋白酶融合的信号蛋白，该蛋白可从膜上切割并释放 TF，使其进入细胞核并激活目的基因的表达。对不同的G蛋白偶联受体 （GPCR）、受体酪氨酸激酶 (RTK)和类固醇激素受体，已使用Tango方法激活转基因表达[5]。

任何已知的天然受体都无法精准识别众多可作为诊断或治疗目的的有价值的分子。为了拓展编辑细胞可以感知的分子库，合成受体已在细胞外与选自噬菌体展示文库的抗体单链可变片段(scFvs)融合，以靶向基于小分子或基于蛋白质的抗原。这种方法已在模块化细胞外传感器架构(MESA)载体中采用，该载体使用针对血管表皮生长因子的 scFv[6,7]。作为Tango样受体，MESA受体基于将TF隔离在质膜上的前提下，在被可溶性配体激活后，蛋白水解释放。但是，与Tango受体不同，MESA受体依赖于配体诱导的受体链二聚化：一条链通过蛋白酶切割位点与 TF融合，另一条链与适当的蛋白酶融合。有研究证明了MESA受体可以通过使用与转录激活域融合的催化死亡Cas9蛋白(dCas9)来调节内源基因表达(dCas9-TF)。配体结合触发dCas9-TF的释放，然后与靶向IL2基因座的单导RNA(sgRNA)结合以驱动细胞因子的表达[8]。然而，MESA方法有显著的缺点：到目前为止，MESA系统在没有配体的情况下显示出明显的活性，并可在配体结合后对基因表达进行适度的折叠诱导，从而导致出现假阳性的诊断结果。

最近，将Tango架构与dCas9转录因子相结合的工作在被优化后得到了更好的性能。基普尼斯等人设计将dCas9嵌合受体用于8种天然或进化的GPCR，可感应多种配体，包括合成小分子、激素、有丝分裂原、趋化因子和脂肪酸。将蛋白酶与GPCR的C端融合，将dCas9-TF与受体激活后募集的信号分子融合的策略优于原始的Tango架构（TF与受体融合，蛋白酶与募集的蛋白质融合）。此外，优化了将蛋白酶与受体融合的接头的长度和组成，以实现更好的开关活性。Baeumler等人[9]开发了一个类似的系统，系基于拆分dCas9的策略。为了在关闭状态下实现较低的基础表达和激活剂处理后的较高诱导，他们筛选了控制受体dCas9分裂部分融合表达的启动子，并在受体和蛋白酶切割位点之间添加了该输出信号。

基于Tango和基于MESA的方法没有利用进化的天然信号级联实现信号放大，这可能限制了它们的效率（每个激活受体仅释放一个TF）。此外，它们的性能高度依赖正确选择启动子以调节不同组分之间的比例。最近报道的广义细胞外分子传感器(GEMS)避免了这些问题[10]。GEMS架构是基于促红细胞生成素受体与不同的配体结合结构域的融合，以感知和响应广泛的细胞外可溶性分子。重要的是，GEMS受体的细胞质域由特定的信号域组成，用于激活四个可能的内源性信号通路（JAK/STAT、ERK/MAPK、磷脂酶C和PI3K/AKT）来同时驱动目的基因的转录程序。GEMS面临着涵盖大范围的非信号分子的挑战，包括癌症生物标志物前列腺特异性抗原(PSA)，并在配体介导的受体二聚化时实现基因表达的高倍数诱导率。重要的是，PSA传感GEMS能够对被诊断为前列腺癌的患者的血清样本进行分类。由于GEMS可以轻松适应新的可溶性抗原，因此有望成为开发基于细胞的多种疾病的诊断或治疗的有效工具。

2 动物细胞表面结合分子的传感响应回路的研究进展

感知和响应结合到其他细胞表面的分子的合成受体最著名的例子是所谓的嵌合抗原受体(CAR)。它们是临床上最先进的工程T细胞，是细胞融合支持新疗法的一个例子[11]。CARs包含细胞外抗体衍生的scFv或纳米抗体，针对肿瘤相关抗原和T细胞受体复合物的细胞内调节域。表达CAR的T细胞能够检测并攻击带有靶抗原的癌细胞。

尽管在细胞因子释放增加和对非癌细胞的攻击方面仍然存在安全问题，但是，以B细胞特异性抗原CD19为靶点的CAR的临床结果显示出治疗淋巴瘤的显著疗效[12]。为了更严格地控制这种疗法，已经提出了几种编辑策略[13,14]，包括与另一类受体的组合，这些受体依赖于Notch受体 (synNotch)的蛋白水解核心[15]。SynNotch受体由细胞外和细胞内结构域组成，能够对输入和输出进行编程。与天然Notch信号传导一样，SynNotch受体通过与邻近细胞中表面结合的抗原结合而被激活，触发合成TFs的蛋白水解释放，然后可以调节目标基因的表达。这些嵌合受体被设计用来感知来自免疫抑制性肿瘤微环境的抗原，并通过表达免疫刺激分子来做出反应。重要的是，SynNotch和CAR受体可通过结合来限制T细胞的激活，因此它仅在携带两种靶抗原的肿瘤细胞出现时被激活。

作为靶向细胞结合抗原分子的一种方法，HEK细胞最近被设计成细胞间接触信号通路，能够识别癌细胞并在与靶细胞结合后释放杀伤酶[16]。JAK-STAT信号由IL4和IL13受体部分的异二聚化介导，被用作载体来构建合成的细胞特异性接触传感装置。IL4和IL13受体的细胞外结构域可与针对乳腺癌标志物人表皮生长因子受体2(HER2)的scFv融合。此外，磷酸酶CD45胞内结构域被用作JAK-STAT信号传导的有效阻断剂。杀伤细胞与靶细胞的结合消除了这种抑制，其通过STAT6诱导信号传导，并从合成的STAT6响应启动子中表达所选基因。为了进行概念验证，使用与细胞穿透肽融合的前体切割酶开展转录输出。回路转导的HEK杀伤细胞可以区分表达HER2的HEK细胞并提供杀伤程序。重要的是，该杀死模块可移植到临床使用的人类间充质干细胞中，这可以杀死携带HER2的SKBR3乳腺癌细胞。

综上所述，这里描述的编辑受体库允许细胞进行高度复杂的编程，以响应人体内的多种生化信号，并根据相邻细胞和环境做出决定。

3 动物细胞作为诊断工具的研究进展

关于使用编辑细胞进行诊断的研究，无论是通过将细胞暴露于人类临床样本进行体外诊断，还是通过将细胞植入体内进行体内诊断，设计的回路必须包含具有易于测量的输出的报告模块。

为了弥补目前过敏诊断方法的缺陷，包括重现性差和与临床症状的相关性差等，研究人员基于组胺传感装置开发了一种受体外诊断方法[2]。组胺通过结合和激活组胺GPCR(HRH1-4)来介导过敏症状。HEK细胞被设计用于其中一种受体(HRH2)的异位表达，并且相应的cAMP信号通路被重新连接以通过合成的cAMP响应启动子驱动报告基因表达。将人类全血样本暴露于过敏原会触发免疫效应细胞（如嗜碱性粒细胞）释放组胺，从而在体外模拟患者体内特定的过敏反应。当编辑细胞暴露于用不同浓度过敏原处理的人体血液样本时，他们可以根据暴露水平对样品进行检测。

相关研究也在体内诊断方面取得了长足的进步，可以加快实现对病理状况的近实时监测。有研究人员创建了一种新的体内诊断策略，该策略借由植入的工程细胞来实现，当检测到血液中疾病生物标志物水平的变化时，这些细胞会产生皮肤纹身[17]。编辑细胞可持续监测血钙并产生黑色素以响应持续的轻度高钙血症，并在移植了这些细胞的患者的皮肤上产生可见的黑色标记。这种诊断性纹身的设计是通过将异位表达的钙受体CaSR的信号级联重新连接到嵌合启动子，从而触发酪氨酸酶的Ca2+响应性表达，最终产生黑色皮肤色素黑色素。作为概念验证，生物医学纹身系通过对接种乳腺癌或结肠癌细胞的小鼠的持续性的与癌症相关的高钙血症反应，有效地诊断出小鼠的无症状结肠癌和乳腺癌。在一个更接近人的模型中，微囊化纹身工程细胞被放置在猪的皮肤下，并在血钙水平升高的动物皮肤中形成基于黑色素的黑色纹身。在具有已知风险因素的患者体内植入这种用于检测前早期癌症的诊断工具可以增加治疗的选择性和存活率。

虽然过敏诊断方法系基于感知组胺，但IL-4和IL-13细胞因子也可用作信号输入，以开发过敏细胞疗法[18]。当免疫系统暴露于特定的过敏原时，Th2细胞会释放大量的细胞因子。此外，中和过敏患者血液中的IgE抗体已被证明可以减轻症状。因此，设计了一种合成装置来检测IL-4或IL-13的存在，并触发能够结合并灭活IgE抗体的设计锚蛋白重复蛋白（DARPinE279）的产生。

4 结论与展望

编辑动物细胞具有从根本上改变诊断、预防和治疗方法的潜力。正如我们上面所讨论的，已经提出了几种策略来提高工程化T细胞的功效和安全性。此外，最近克服了仅针对肿瘤细胞表面结合抗原的严格限制，从而可以将CART细胞疗法扩展到可溶性抗原，在结合后诱导受体二聚化。

与此同时，随着基因编辑研究手段的多样化，将为应对随着临床实验增加而不可避免地出现的新挑战提供空间。例如，截至今天仍然缺乏具有快速响应特性的合成回路，故难以使患有糖尿病等疾病的患者受益。为了实现几分钟的响应时间这一目标，其回路必须绕过基于转录的缓慢响应，而依赖于转录后事件。