军团菌耐药现状及耐药机制研究进展

赵子睿 张怡 李萍 陈愉

中国医科大学附属盛京医院呼吸与危重症医学科,沈阳 110004

军团菌是一种革兰阴性杆菌,因在1976年的一次美国退伍军人会议上首次暴发并被分离鉴定而得名。该菌广泛分布于自然界的水和土壤环境中,也存在于公共供水系统如自来水管道、空调冷却塔水及浴室温泉等环境中[1],患者吸入含有军团菌的气溶胶后细菌进入肺泡巨噬细胞内,在其特有的四型分泌系统作用下,军团菌能够成功地躲避溶酶体酶的杀菌作用,并在巨噬细胞中生存繁殖,从而导致军团病的发生[1-2]。军团病,表现为军团菌感染的肺炎型和非肺炎型两种,非肺炎型又称庞蒂亚克热,症状表现类似流感,以发热为主要表现,为自限性疾病；肺炎型军团病常表现为重症社区获得性肺炎。我国于1982年在南京发现国内首个病例,随后国内相继出现多起军团病的暴发与散发病例,但以散发为主[1,3]。目前已知的军团菌有61种71个血清型,同时还有新的菌种不断从环境中被发现并分离[4]。在军团菌中,引起人类军团病的主要病原是嗜肺军团菌,其中又以血清型1型嗜肺军团菌(Legionella pneumophila1,LP1)为主[5]。自1976年以后,全世界范围内越来越多的与社区、医院及旅行相关的军团病病例及其小规模暴发被报道[6],其严重程度从轻度到重度不等,平均病死率为10%,而对于病情危重,未得到及时治疗的免疫力低下的患者,其平均病死率达到30%[7]。在临床上,通常使用大环内酯类和氟喹诺酮类药物对军团菌感染进行治疗[8],近年来,不断有研究人员通过在抗菌药物环境下对军团菌菌株进行连续传代培养得到了高度耐药的军团菌菌株,证实了军团菌产生耐药的可能性[9-11]。同时,国内外均发现环境中分离出的菌株对治疗药物存在耐药的情况[12-13]。由于军团菌肺炎在临床常为重症,及时有效的治疗对预后至关重要,一旦产生耐药,将危及患者生命。尽管新近应用的替加环素等四环素类抗菌药物被报道对于治疗军团菌肺炎有较好的治疗效果,但未见军团菌对该类药物耐药方面的研究。因此,本文重点针对大环内酯和氟喹诺酮类的耐药现状及耐药机制作一综述,临床医生对该方面的了解将为治疗决策的制定及调整提供参考。

一、不同来源的军团菌耐药现状

(一)来自环境的菌株

军团病主要通过吸入环境中污染军团菌的气溶胶发病,因此对环境中军团菌的耐药性监测显得十分重要。国内学者Jia等[14]对收集自2005-2012年的149株嗜肺军团菌1型菌株进行了药敏检测,这些菌株包括来自北京、上海、深圳、无锡、济南、石家庄等地的临床军团病患者的19株临床菌株和来自医院、社区等公共场所的冷却塔水、温泉水和管道水环境中的130株环境菌株,最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)范围为0.032～2.0 mg/L,其中25株军团菌存在对阿奇霉素的耐药,耐药率为16.78%(25/149),并且这25株全部是来自环境的菌株,占环境菌株的比率达19.23%,基于测序分型(sequencing based typing,SBT)显示这25株耐药菌株包括ST1、ST150、ST144、ST629和ST154,其中ST1型的菌株占到所有耐药株的84%。在149株军团菌菌株中没有发现对左氧氟沙星,环丙沙星及利福平耐药的菌株。董颖等[15]在进行军团菌的体外药物活性研究时也发现10株对阿奇霉素MIC＞1 mg/L的嗜肺军团菌菌株,其中7株为血清型1型,另外3株为非血清型1型的嗜肺军团菌菌株,但它们均为环境中分离的菌株,没有发现对氟喹诺酮类药物耐药的菌株。在2017年,波兰的研究人员在一家疗养院的供水系统中分离出了一株对阿奇霉素耐药的非血清型1型的嗜肺军团菌,并且该耐阿奇霉素菌株同时表现为对环丙沙星和利福平的敏感性降低[12]。2019年,挪威的研究人员对收集自环境的67株和来自临床患者的55株军团菌进行了药敏检测,其MIC范围为0.032～1.0 mg/L,其中17.91%的环境菌株都存在对阿奇霉素敏感性降低,并且所有对阿奇霉素的MIC≥0.5 mg/L的菌株均带有外排泵基因,同时受试菌株中所有ST1型菌株均存在对阿奇霉素的敏感性降低的现象,没有发现对环丙沙星和左氧氟沙星等氟喹诺酮类药物耐药的菌株[16]。在对希腊一所医院进行的供水系统采样检测中发现,在所分离的20株嗜肺军团菌菌株中,有3株对红霉素有轻微耐药,其中2株MIC为1 mg/L,另一株为0.75 mg/L,另有2株对环丙沙星存在轻微耐药,MIC为2 mg/L[17]。此外,印度的医院供水系统中分离出环丙沙星MIC=2 mg/L的嗜肺军团菌菌株,但未发现对阿奇霉素存在耐药的军团菌菌株[18],意大利一家医院的供水系统中发现2株阿奇霉素MIC=3 mg/L和MIC=4 mg/L的嗜肺军团菌菌株,但并未发现对环丙沙星存在耐药的菌株[19]。这些抗药性在地理上存在一定差异,可能是由于医疗卫生状况的实践,也有可能是由于每个国家的农业、渔业和肉类行业的抗菌药物使用水平和状况不同[20],从而导致了军团菌的耐药基因在不同地理分布上出现了差异[21]。显而易见的是,不同区域菌株敏感性的数据对指导当地临床治疗更有实际意义,在临床用药过程中应予以考虑和重视。

(二)来自临床的菌株

在军团病的治疗中,军团菌耐药性的检测对其具有重要意义。通过以往的研究资料来看,在实验室中,可以很容易通过培养筛选得到具有对大环内酯类药物或氟喹诺酮类药物具有耐药性的嗜肺军团菌菌株[10-11,22],然而临床上并没有出现对大环内酯类药物具有耐药的军团病病例报告,但是存在对阿奇霉素敏感性降低的临床分离株亚群,利用分子系统发育分析LP1的阿奇霉素MIC和LP1菌株的SBT分型型别关系后,研究人员发现来自临床的军团菌菌株对阿奇霉素敏感性降低与lpe AB基因编码的大环内酯外排泵有关[9]。在Natas等[16]研究收集自2000-2017年的55株临床菌株中有9株对阿奇霉素敏感性降低,达到16.36%,他们的后续研究也显示这些对阿奇霉素敏感性降低的菌株均存在lpe AB外排泵的表达。而对氟喹诺酮类药物具有耐药的临床分离的菌株,目前报告较少[23]。2012年,Bruin等[24]研究报道了一株嗜肺军团菌菌株的临床分离株,其对阿奇霉素和环丙沙星的耐药性超出了其野生型范围,其中环丙沙星MIC为2 mg/L,阿 奇 霉 素MIC为6 mg/L。2014年,Bruin等又从1例环丙沙星治疗失败的军团病患者身上分离出来对环丙沙星耐药的军团菌菌株,其环丙沙星的最低抑菌浓度为2 mg/L,超出其流行病学界值(epidemiological cutoff,ECOFF)1 mg/L,具有潜在耐药性,在后续对该菌株的基因测序结果中,显示其耐药性来自gyr A基因喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance-determining region,QRDR)的点突变[23]。随后,在一项有82例互不相关的军团病患者参与的临床研究中,Shadoud等[25]对来自82例军团病患者住院和抗菌药物治疗期间的共139份呼吸道标本进行实时PCR检测,并进行了深度测序检测了嗜肺军团菌的抗性突变,通过对患者抗生素治疗过程的不同时期呼吸道标本进行实时荧光定量PCR确认和量化标本中QRDR突变区Gyr A基因的变化情况,动态监测了患者体内军团菌的耐药基因水平,结果显示存在QRDR gyr A突变的两例患者中,第一例患者确诊军团病当天的呼吸道样本中的军团菌gyr A83突变基因的频率为2.9%,而在其接受氟喹诺酮类药物治疗4 d后的样本中军团菌gyr A83突变基因的频率上升为94%；另一例患者在确诊军团病当天的标本中军团菌的gyr A83突变基因频率为1.05%,而其氟喹诺酮类药物治疗后的第3天和第5天标本中军团菌的gyr A83突变基因频率上升为75%和85%,其研究结果证明了军团病患者体内嗜肺军团菌耐药性选择的发生与氟喹诺酮类药物的应用有直接关系,并且其耐药性选择发生于氟喹诺酮类药物治疗之后。

二、军团菌耐药的机制

(一)军团菌对大环内酯类药物的耐药机制

大环内酯类药物的主要抗菌机制为透过细胞膜进入军团菌内与军团菌70S核糖体的50S亚基结合,结合位点为蛋白质合成过程中必须的肽链延长段,与t-RNA结合位点形成竞争效应,抑制军团菌菌体蛋白的合成,从而达到抑菌的作用[26-27]。细菌对大环内酯类药物的耐药性获得主要通过以下机制:通过甲基化酶修饰核糖体靶标[28],点突变修饰核糖体上大环内酯类药物作用位点[29-30],以及染色体过度表达或产生获得性外排泵系统[31]。关于军团菌对大环内酯类药物的耐药机制,目前研究有以下几种情况。在由于外排泵的存在而导致耐药性的研究中,Vandewalle-Capo等[9]在大环内酯类药物浓度逐渐增高的情况下通过对军团菌进行连续传代,获得了对阿奇霉素具有高水平耐药性的军团菌菌株,他们的研究结果显示lpe AB外排泵的高表达赋予了军团菌这种抗性[9]。lpe AB外排泵是发现于军团菌的大环内酯类耐药外排泵,以阿奇霉素为特异性底物。这种外排泵同源于大肠杆菌的Acr AB外排泵,是RND外排泵家族成员[22]。lpe AB操纵子上游序列的突变,导致了这种外排泵的过度表达。挪威研究人员Natas等[16]通过对搜集自临床和环境中的共122个嗜肺军团菌菌株进行了抗菌敏感性检测并进行了全基因组测序,他们的研究结果表明对阿奇霉素敏感性降低的嗜肺军团菌菌株,均存在lpeAB外排泵的高表达特性。

军团菌对大环内酯类药物敏感性降低也可以来自核糖体点突变,Descours等[11]通过对来自同一敏感菌株培育得到的12个独立谱系进行全基因组测序,分析共有突变,发现嗜肺军团菌对大环内酯类药物耐药性的增加与核糖体突变有关。其主要的突变位点是编码L4、L22和23S r RNA的基因,rpl D或rpl V基因的点突变或插入、缺失等主要发生在进化过程的早期,它们影响了L4(Q62～G66)和L22(P87～G91)蛋白中两个高度保守的5个氨基酸区域,这两个区域位于大环内酯类药物结合位点附近的核糖体出口隧道中的狭窄结构环上,影响了大环内酯类药物与军团菌核糖体的结合,造成了军团菌对部分大环内酯类药物的最低抑菌浓度出现轻度上升。耐药机制产生的后期则主要是23S r RNA发生的突变,rrl基因突变使得选择药物的最低抑菌浓度出现大幅上升,这与肽基转移酶区域内的4个核苷酸位点有关,即23S r RNA结构域V的2057、2058、2059和2611这4个位点。位点2058和2059是大环内酯类药物结合的关键核苷酸,而碱基对2057和2611是负责关闭肽基转移酶区域单链部分之前的茎。这些位置的核苷酸突变虽发生较晚,但导致了军团菌对大环内酯类药物的最低抑菌浓度明显增加[11]。

(二)军团菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制

氟喹诺酮类药物主要通过抑制军团菌的DNA促旋酶来干扰军团菌DNA的复制,从而起到抑制军团菌增殖生长的作用。Jonas等[32]在嗜肺军团菌对氟喹诺酮类药物耐药的体外选择实验过程中发现,嗜肺军团菌出现对氟喹诺酮类药物耐药与gyr A基因发生突变有关,gyr A的第83位氨基酸序列出现T83K或T83I改变,与军团菌出现对氟喹诺酮类药物耐药有关。Almahmoud等[10]在含有环丙沙星的培养基中通过连续传代,得到8株耐药性从低到高的军团菌谱系。进行基因检测,进一步发现在嗜肺军团菌出现对氟喹诺酮类药物的耐药过程中,突变影响了拓扑异构酶Ⅱ编码基因的gyr A、parC和gyrB三个位点。gyr A首先发生突变T83I,然后是parC中发生G78D或S80R点突变,最后gyr A中再次发生突变D87N得到相比初代菌株对莫西沙星浓度提高512倍的耐药菌株。在Shadoud等[25]研究利用实时荧光定量PCR和二代测序技术,通过检测来自住院和抗菌药物治疗期间的军团病患者的呼吸道样本,检测患者标本中军团菌对氟喹诺酮类耐药基因含量的变化,证明了体内对嗜肺军团菌gyr A83突变株的选择与氟喹诺酮类抗菌药物在患者体内的显著增加有关,并且氟喹诺酮类药物对嗜肺军团菌的耐药性选择发生在药物治疗期间,该研究说明氟喹诺酮类药物在临床应用过程中可诱导军团菌耐药,并且其发生概率并不低。

综上所述,关于环境及临床军团菌菌株对大环内酯和氟喹诺酮类药物的耐药国内外均有报道,虽然研究尚不多,但已观察到临床用药过程中诱导耐药的发生,值得临床医生关注。由于临床标本分离军团菌困难,菌株耐药性难以判断,个别重症患者,即使应用了抗军团菌药物,仍未逆转其不良预后。对于致死性病例,不良预后是否与药物耐药有关,有待于未来进行深入研究。在危重症治疗过程中,临床医生应关注耐药情况的发生,有条件情况下可进行军团菌培养,进而做药物敏感性检测。如无军团菌分离培养的条件,可利用二代测序技术监测标本中相应耐药基因的载量及其变化,分析患者体内军团菌是否存在对特定药物的耐药突变[25]。当单药治疗失败不除外耐药发生时,联合治疗可能对预后有益。

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