FEZF1-AS1在非小细胞肺癌发生中的作用研究进展

周丽亚 李小利 曹子肖 向俊馨 刘佳慧 李殿明

蚌埠医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科 呼吸系病临床基础安徽省重点实验室 233004

肺癌是世界上发病率和病死率最高的恶性肿瘤,据2020年全球肿瘤流行病统计数据GLOBOCAN分析报告显示,全球肺癌新发例数达220.7万；死亡例数达179.6万[1]。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占全世界所有肺癌病例的绝大部分,分为腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌等[2]。近年来,NSCLC的治疗尽管采用了多种手段,但5年生存率仍较低,其原因在于,NSCLC诊断时大多已处于中晚期,因而导致生存率低。因此,筛选新的生物标志物对NSCLC的早期诊断意义重大。

长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一组位于细胞核或胞质内且长度大于200 nt的RNA,是机体内基因转录过程中的副产物,不具有任何生理活性[3],但具有包括保护蛋白质编码基因在内的多种生物学功能,从而影响着细胞增殖、分化、侵袭转移、凋亡、细胞周期及基因组稳定性[4]。

近年研究发现lncRNA在恶性肿瘤发生发展中具有重要作用,对包括肺癌在内的恶性肿瘤的早期诊断和治疗中具有重要意义[5]。然而,这些lncRNA中绝大多数的功能尚未能确定。FEZ家族锌指1反义RNA1(FEZ family zinc finger 1-antisense RNA 1,FEZF1-AS1)作为一种新发现的lncRNA,已经证实在各种肿瘤中上调,参与肿瘤的进展,其潜在的应用前景包括肿瘤的分子诊断、治疗和预后评估等方面。本文就FEZF1-AS1在NSCLC发生中的作用研究进展作一综述。

1 FEZF1-AS1概述

FEZF1-AS1是一种新发现的lncRNA,从7号染色体的加链转录,定位于编码FEZF1的同源基因的相反链上,位于7q31.32号染色体上,产生2 564 bp转录本,含有7个外显子,其中有611个互补核苷酸存在于FEZ F1-AS1第一外显子和FEZ F1第一外显子之间[6]。到目前为止,已发现包括FEZF1-AS1-1201(679 bp,1个外显子),FEZF1-AS1-202(2 653 bp,3个外显子),FEZF1-AS1-203(768 bp,1个外显子)在内的FEZF-AS1的3个剪接变异体[7],然而它们都不具备编码蛋白质的功能。FEZF1-AS1表达上调在多种类型的癌症中可被发现,但在肿瘤细胞中的位置有不同的看法,且与肿瘤的关系密切,参与其发生发展过程。

2 FEZF1-AS1在NSCLC中的表达

He等[8]检测NSCLC组织和邻近正常组织中FEZF1-AS1的表达水平是通过采用定量逆转录聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,q RTPCR)方法,结果表明,NSCLC组织中FEZF1-AS1的表达较高,其表达水平与NSCLC患者分化程度、淋巴结有无转移和TNM分期密切相关。FEZF1-AS1在NSCLC细胞系(A549、SPC-A1、H1299和PC9细胞)中也显示出其表达水平高于正常肺细胞16HBE,因此认为,FEZF1-AS1在肺癌的发生发展中具有重要意义,可以作为NSCLC的癌基因。另外,Liu等[9]研究中指出,高水平的lncRNA FEZF1-AS1与肺腺癌(lung adenocarcinoma,LAD)细胞的侵袭性表型和LAD患者的预后不良有关。LAD细胞系(SPCA-1,NCI-H1299,A549,NCI-H441和LTEP-a2)和正常肺上皮细胞(BEAS-2B),siRNAs转染敲除FEZF1-AS1,应用实时聚合酶链反应(real-time PCR,RT-PCR)测定了FEZF1-AS1在LAD组织和相应正常组织中的表达水平,结果显示FEZF1-AS1在LAD组织中过表达,且与分化程度和淋巴结转移有关,但与年龄、性别、吸烟和TNM分期无明显关联。通过细胞学实验进一步发现FEZF1-AS1水平与FEZF1水平呈正相关,FEZF1-AS1负调控FEZF1的表达在LAD细胞中起癌基因的作用,且两者之间的相互作用已被报道[10]。

在肺鳞状细胞癌(lung squamous cell carcinoma,LSCC)的研究中[11],收集37例LSCC组织和邻近的非肿瘤组织,应用RT-PCR测定及Kaplan-Meier分析结果显示FEZF1-AS1的低表达预测了LSCC的不良预后。同时,采用Kaplan-Meier方法和log秩检验分析发现高水平的FEZ F1-AS1与预后不良有关。

研究显示[12],血浆lncRNA FEZF1-AS1也可作为诊断NSCLC的潜在生物标志物。该研究中抽取126例NSCLC患者和62例健康对照者的血浆,采用qRT-PCR方法检测两组FEZF1-AS1表达水平,采用化学发光法检测血浆神经元特异性烯醇化酶(neuron-specifific enolase,NSE)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和CYFRA21-1水平。结果表明,FEZF1-AS1在NSCLC患者中具有较高的表达,进一步比较了FEZF1-AS1对CYFRA21-1、NSE和CEA的诊断能力,并通过二元Logistic回归计算FEZF1-AS1和NSE的联合诊断能力,结果表明,与FEZF1-AS1或NSE单独相比,FEZF1-AS1和NSE联合诊断能力明显提高,换言之,FEZF1-AS1和NSE的结合使诊断更具权威性及临床意义。统计学分析其表达与临床特征及风险性之间的关系,结果显示:与远处转移、淋巴结转移、临床分期、肿瘤大小和疾病状态有关；高水平表达的FEZF1-AS1其NSCLC风险性显著增加,且存在显著的浓度依赖性关系。

越来越多的研究表明[13]FEZF1-AS1过表达与NSCLC的分化程度、疾病分期和淋巴结转移有关。此外,Meta分析结果表明,FEZF1-AS1的失调已在许多癌症中被报道,在肿瘤组织和细胞系中的表达增加与癌症患者较短的总生存率和无病生存率显著相关,并与预后不良和晚期临床病理参数有关[14]。因此,FEZF1-AS1在肿瘤的治疗靶点中可能具有潜在的重要意义,并被认为在该疾病的形成过程中可能起促进作用。

3 FEZF1-AS1在NSCLC发生发展中的作用

3.1 上皮-间充质转换通路 研究[8]表明下调FEZF1-AS1可抑制NSCLC的细胞增殖、集落形成、细胞侵袭和上皮-间充质转换过程,而通过调节Wnt/β-catenin信号通路也可调节EMT过程。在A549和SPC-A1细胞系中,通过沉默细胞系中的FEZF1-AS1,发现Slug,twist和Vimentin表达水平明显下调,而钙黏附蛋白E(E-cadherin)和ZO-1表达水平明显上调；进一步的研究证实FEZF1-AS1可通过与EZH2相互作用抑制E-cadherin的表达,若敲除FEZF1-AS1或EZH2则增加了E-cadherin在A549和SPC-A1细胞中表达；通过染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)和RNA免 疫 沉 淀 实 验(RNA immunoprecipitation,RIP)测定结果显示,FEZF1-AS1在A549细胞和SPC-A1细胞中能与EZH2和LSD1结合。因此,我们认为FEZF1-AS1促进细胞EMT可通过抑制NSCLC中的E-cadherin来实现。

3.2 p57通路 p57是细胞周期素依赖性激酶的抑制剂,被认为是抑癌基因,在许多癌症中失调。在对LAD的研究中,Jin等[15]评价了CDK抑制剂(p15,p16,p21,p27,p57)的表达,结果显示,沉默FEZF1-AS1可显著提高p57的水平,即FEZF1-AS1也可通过靶向p57在人LAD中起癌基因的作用。通过应用RIP证实了FEZF1-AS1可以直接与LAD细胞中的EZH2结合,而p57也是NSCLC中EZH2的直接靶点[16],进一步的实验表明沉默的FEZF1-AS1可以显著增加p57的水平,而EZH2的敲除也明显增加了p57在LAD细胞中的表达水平,提示FEZF1-AS1可能通过与EZH2的相互作用来调节p57。此外,CHIP检测表明,FEZF1-AS1可以将EZH2招募到p57启动子区域并抑制其转录,从而促进LAD的进展。

3.3 作为miRNA海绵 有研究显示[17],许多miRNA结合位点存在于多种RNA转录本上,即不同的RNA转录本可以具有相同的miRNA结合位点,它们能够竞争共享相同的miRNA,调节靶向的RNA,进行相互交流,从而充当相互竞争的内源性RNAs,进而影响疾病的各种过程,其中就包含lncRNAs,此为所谓的竞争性内源性RNA(competing endogenous RNAs,ceRNAs)假说。一方面,lncRNAs对miRNA海绵的作用在确定miRNA水平及其翻译抑制的潜力方面显然是至关重要的；另一方面,它大大增加了miRNA-RNA相互作用网络的复杂性。FEZF1-AS1是一种新发现的lncRNA,同样具备这种作用。

Huang等[18]分析NSCLC中FEZF1-AS1与miR-34a的关系及其对NOTCH-1的影响。细胞培养人NSCLC细胞系(H1993)及选取177例NSCLC患者,进一步的细胞学实验并结合RT-PCR测定FEZF1-AS1和NOTCH-1m RNA的表达水平,分析其数据表明,NOTCH-1 m RNA的表达水平在非肿瘤组织中明显低于NSCLC组织,且FEZF1-AS1和NOTCH-1呈显著正相关,表明它们之间可能存在相互作用；细胞转染实验表明,H1993细胞中miR-34a、FEZF1-AS1和NOTCH-1的表达水平明显上调,此外,FEZF1-AS1和miR-34a的过度表达对彼此的表达并无显著影响,相反,FEZF1-AS1的过度表达可使NOTCH-1的表达上调,而miR-34a过度表达介导下调的NOTCH-1和FEZF1-AS1过度表达的减少效应。因此FEZF1-AS1可作为miRNA海绵调节miR-34a上调NOTCH-1,从而对癌细胞的侵袭和迁移具有促进作用。Song等[19]细胞学培养出肺癌细胞系(H1299和H520),通过细胞转染及miRNA模拟FEZF1 AS1、ITGA11和miR 516b 5p,此外,用RTqPCR及Westernblot分析证实,miR-516b-5p在H1299和H520细胞中过表达,而ITGA11的表达在miR-516b过表达后降低；敲除FEZF1-AS1基因后,ITGA11蛋白水平降低,进一步研究了两者之间表达的相关性,结果显示H1299和H520细胞中,FEZF1-AS1过 表 达在m RNA和蛋白质水平上均显著上调ITGA11-1的表达,在miRNA过表达后,miR-516b-5p显著下调FEZF1-AS1的表达。细胞学实验提示miR-516b-5p和FEZF1-AS1可能共享一个结合位点,ITGA11受miR-516b-5p和FEZF1-AS1的调控。因此,FEZF1-AS1可作为ceRNA,调节NSCLC中miR-516b-5p及其靶基因ITGA11。

4 FEZF1-AS1参与EGFR-TKIs耐药

对于EGFR突变阳性的患者在使用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)后的8～12个月内往往会失去临床活性,即产生了继发性耐药。目前已将其耐药的机制以及耐药后的治疗作为研究重点。关于EGFRTKIs耐药的机制目前多承认以下几种:(1)继发性EGFR突变的发生；(2)激活旁路信号；(3)组织病理学转变；(4)下游信号通路的激活。LncRNAs已被证实参与一系列细胞过程,并在不同细胞位置的表观遗传转录和转录后水平上调节基因的表达,并通过多种机制参与调节癌细胞的生长、转移和化疗耐药性。已有相关研究显示lncRNAs可能对NSCLC的EGFR-TKIs耐药的调控具有重要意义。

4.1 lncRNA-UCA1参与耐药 Xu等[20]研究了NSCLC中lncRNA-UCA1在EGFR-TKIs耐药中的机制。结果发现在获得性吉非替尼耐药的NSCLC组织和细胞(PC-9/GR)中lncRNA-UCA1上调,进一步研究显示,患者的PFS与UCA1表达水平呈负相关,过表达可能是预后不良的新指标或吉非替尼治疗的进展标志；RIP及CHIP检测证实UCA1与EZH2结合,CDKN1A是UCA1/EZH2调控基因的真正靶点。细胞学实验也证明UCA1可能通过抑制细胞凋亡、G1-S检查点、表观沉默CDKN1A转录来驱动NSCLC中吉非替尼的耐药性。此外,Chen等[21]利用生物信息学在线程序和荧光素酶报告试验验证了UCA1在NSCLC细胞中作为miR-143的分子海绵,两者在吉非替尼耐药细胞系中呈负性表达,FOSL2是miR-143的靶点,免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)结果表明,FOSL2在吉非替尼耐药NSCLC患者组织中的表达显著上调。即UCA1/miR-143通路有助于过度表达UCA1的吉非替尼耐药细胞系中的吉非替尼耐药,对NSCLC中TKI获得性耐药的治疗具有潜在的治疗价值。这与有关对LINC00460,HOST2在吉非替尼耐药中的作用机制的研究相似,均可作为miRNA的分子海绵[22-23]。由此可得出,lncRNA可能会模仿miRNA的靶点,从而用海绵状的miRNA来减弱它们对沉默下游基因的影响,借此在NSCLC耐药机制中发挥重要作用。

Wang等[24]分析了HOTAIR与EGFR-TKIs相关的耐药机制。研究中采用qRT-PCR检测出HOTAIR在肺癌细胞系(PC9/R、H1975、H1299和A549)和耐吉非替尼患者中低表达,且患者的PFS明显下降；细胞转染及Western Blot实验表明HOTAIR的过表达会诱导EGFRTKIs耐药的细胞凋亡,降低了Vimentin和N-cadherin的表达,而增加了E-cadherin的表达,即HOTAIR促进吉非替尼的耐药性可以通过激活EMT来实现。该研究提示HOTAIR可能是预测EGFR-TKIs耐药的潜在指标。事实上,EMT过程涉及到控制细胞生存、增殖和稳态的整个信号网络的重组,以Vimentin的表达升高和E-cadherin的表达下降为特征,使肿瘤细胞依赖于新的分子途径,并对靶向治疗不敏感,从而被认为广泛参与EGFR-TKIs的耐药途径。

4.2 LINC00665参与耐药 Liu等[25]通过研究分析了LINC00665与EGFR-TKIs相关的耐药机制。将20例晚期NSCLC患者活检标本分为两组:从未接受过吉非替尼(NG)治疗组和耐受吉非替尼(GR)组,与NG组比较,LINC00665在GR组患者中的表达水平显著增加,且细胞学实验也表明其在吉非替尼耐药细胞(PC9/GR)中的表达水平约为吉非替尼敏感细胞(PC9)中的5倍。细胞转染及敲除实验显示,相比单独使用吉非替尼治疗,LINC00665敲除联合吉非替尼后可减少细胞迁移,从而预测Si-LINC00665和吉非替尼联合治疗可能是克服NSCLC中获得性吉非替尼耐药性的有效策略。RIP试验和Westernblot结果表明LINC00665能直接结合PC9/GR细胞中的EZH2从而调控PI3K/AKT通路,敲除LINC00665基因可导致EZH2和非活性PI3K/AKT通路的减少,即LINC00665可能是EGFR-TKI疗效的预测指标。

而FEZF1-AS1已被证实是以上这些耐药机制中的重要调节因子。但其在NSCLC EGFR-TKIs耐药中的作用机制仍需进一步深入研究,为实现其临床潜力提供新的理论基础。

总之,lncRNA FEZF1-AS1可作为一种致癌因子,通过调节信号通路、竞争内源性RNA等多种方式调节基因的表达及蛋白质磷酸化等分子生物学过程,从而调控肿瘤的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为,其抑制剂可延缓肿瘤的发生,进而对调节肿瘤的进展具有重要影响。相关研究证实FEZF1-AS1可能通过多种机制参与调节EGFRTKIs耐药,但仍需要进一步的结构研究来探索FEZF1-AS1在NSCLC的侵袭和癌变中的作用,功能实验来阐明其与NSCLC临床预后不良、耐药及诊断和治疗的关系。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突