军团菌感染所致肺损伤的调控机制研究进展

梁思聪 陈愉

中国医科大学附属盛京医院呼吸与危重症医学科,沈阳110004

军团菌是一种需氧革兰阴性杆菌,广泛分布于温暖潮湿的环境,在天然水源、人工冷水、热水系统以及湿润的土壤中均可生长繁殖。军团菌首先被发现于1976年,美国费城退伍军人年会期间发生不明原因肺炎爆发,在尸检组织中分离出致病病原体并将其命名为军团菌。军团菌是一种兼性胞内寄生菌,目前发现军团菌有58种及3个亚种,所有种类军团菌均可寄生于水生原生动物中,约30种可导致人类感染。人类通过吸入被污染的气溶胶而被感染。90%的病例是由嗜肺军团菌引起的[1],嗜肺军团菌可分为15个血清型。美国及欧洲最常见的致病血清型是1型,占总体病例的80%;而据报道澳大利亚、新西兰的军团病病例中,1型嗜肺军团菌所导致的仅占50%,长滩军团菌占30%[2];我国目前缺乏针对致病军团菌血清型分布的大样本研究数据。军团菌具有摄取裸露DNA 的能力,并因此进行基因水平转移并完成进化,这使得军团菌可以迅速适应环境并且进化出不同的应对策略。

人类感染军团菌后根据临床表现可分为军团菌肺炎和庞蒂亚克热。庞蒂亚克热主要表现为急性流感综合征,无明显肺部病变,3～5 d可自愈。军团菌肺炎表现为急性纤维蛋白化脓性肺炎,呈小叶性分布,进展迅速,极易发展为致命的军团菌感染。军团菌肺炎进展迅速,受临床检测方法限制,病死率很高。欧洲29国收集2011-2015年上报的确诊军团病病例,病死率高达9.3%[3]。军团菌感染后的严重程度与细菌量及感染宿主的免疫程度相关[4]。军团菌感染的危险因素包括:男性、老年、吸烟者、伴有慢性心肺基础疾病、糖尿病、恶性肿瘤、免疫抑制、应用肿瘤坏死因子α拮抗剂的人群[5]。由于军团菌感染后个体差异性很大,对军团菌感染后造成肺部损伤的认识是必要的,本文将对军团菌在感染后造成肺部损伤的调控机制研究作一综述。

1 军团菌感染巨噬细胞机制

军团菌在环境中进化出了可以在原生动物细胞中生存的能力,这种性状同样允许军团菌在哺乳动物巨噬细胞中生存并复制,巨噬细胞在宿主受到军团菌感染的初始阶段起到至关重要的作用,决定着军团病是否发生。军团菌到达呼吸道后首先由于肺泡巨噬细胞的吞噬作用进入细胞内,机体补体系统可增强军团菌进入细胞内部的作用,其主要外膜蛋白可直接激活补体C3,增加其被巨噬细胞吞噬的成功率[6]。细菌进入细胞后即产生一个由膜包裹的界限清晰的囊泡,称为军团菌包含液泡 (Legionella-containing vacuole,LCV),LCV 的形成是需要Icm/DotⅣ型分泌系统 (type 4 secretion system,T4SS)辅助进行的复杂过程。目前研究显示,Arf[7]、Rab[8]、Ran[9]和Rap[10]家族的效应蛋白与LCV 的形成及军团菌的复制有关。由于T4SS的作用,军团菌向宿主细胞中释放超过300 种效应蛋白[11],这些效应蛋白被释放到宿主细胞的细胞质中,招募细胞的内质网与线粒体包绕LCV 周围,成为类似糙面内质网的结构,此后LCV 与内质网紧密且持续地在一起[12]。研究证明,Sid M (Drr A)介导Rab1激活,从而介导内质网与细胞膜来源的囊泡向LCV 募集[13]。磷脂酰肌醇在LCV 的形成中起到重要作用。在使用嗜肺军团菌感染盘基网柄菌的活细胞成像中观察到,军团菌在被细胞吞噬后,瞬时从细胞膜中获取磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸与磷脂酰肌醇-4-磷酸,这一过程在细菌被吞噬后的60 s内完成,而且不需要T4SS作用;60 s之后,吞噬体周围募集了丰富的磷脂酰肌醇-3-磷酸;感染后2 h,在T4SS 的作用下,LCV 表面的磷脂酰肌醇-3-磷酸逐渐脱落,开始缓慢募集磷脂酰肌醇-4-磷酸,LCV 内的体积开始扩张,周围围绕内质网;直到感染后8 h,磷脂酰肌醇-4-磷酸都在进行稳定的累积,磷脂酰肌醇转换是LCV 成熟过程中的决定性步骤,由T4SS进行调控,缺乏Icm 的突变体无法进行转换,从而很快在宿主细胞中被降解[14]。军团菌通过以下几种途径转换磷脂酰肌醇:(1)效应蛋白直接结合膜表面磷脂 (SidC、Sid M、Ank X、Lid A、Rid L、Set A、Ltp M); (2)效应蛋白起到细菌磷酸肌醇磷酸酶 (Sid F、SidP)、磷酸肌醇激酶(LepB、Leg A5)、磷脂酶 (Vip D、PlcC、Lpd A)的作用;(3)通过效应蛋白募集宿主细胞的磷酸肌醇磷脂酶或激酶(RalF、Sid M)[15]。如同其他胞内寄生菌一样,Icm/Dot的效应蛋白发展出了模仿宿主蛋白质的能力,并且干扰宿主细胞的信号传导及交换通路[16],阻止LCV 与细胞内的溶酶体结合,从而使LCV 不被巨噬细胞内的溶酶体破坏,成为一个对于军团菌来说相对安全的环境,使其在内部复制。军团菌在体内的复制可以分为2个阶段,复制期与指数后期。复制期的军团菌存在于LCV 中,无鞭毛,复制期可持续16～20 h,在此期间,LCV 利用吞噬细胞胞质内本身的营养物质,效应蛋白Ank B 通过诱导蛋白酶体水解宿主蛋白,增加军团菌所需的游离氨基酸的含量[17]。另有研究表明,Lgt家族与Sid E家族协同作用,释放宿主细胞的氨基酸供给军团菌利用[18]。为了维持军团菌在细胞内的复制水平,防止复制周期提前终止,效应蛋白Sdh A 维持LCV 膜稳定性,防止宿主细胞内对LCV 膜破坏事件的发生[19]。在感染晚期,LCV 的外膜逐渐降解,军团菌四散于宿主细胞的细胞质中与不同细胞器的外膜上[20],形成有弹性的囊泡样的成熟细胞内结构,当囊泡内的营养成分消耗殆尽,军团菌释放出毒力因子,使宿主细胞破裂。此时的军团菌带有鞭毛,具有高度的运动性和致病力,从破裂的宿主细胞中逃出,被新的巨噬细胞吞噬,开启下一轮感染。

2 军团菌感染后巨噬细胞内的调节机制

军团菌在感染人体之后是否会发展为严重的感染性疾病与其是否能在细胞内大量复制有关。使用野生型军团菌感染小鼠是无法复制军团菌肺炎模型的,使用军团菌感染小鼠的巨噬细胞,发现军团菌无法在细胞中完成复制及生存,这是由于小鼠在感染早期即有效清除了细胞内的病原体并阻止了进一步感染的发生。军团菌进入巨噬细胞后在囊泡内进行复制,细胞自噬是免疫的重要组成部分,细胞识别并吞噬病原体后启动自噬程序,限制病原体在内部的复制,但目前已发现军团菌通过多种效应蛋白调节宿主细胞的自噬作用。Choy 等[21]发现,效应蛋白RavZ 通过将Atg8/LC3从磷脂酰乙醇胺上解离来抑制细胞自噬。效应蛋白LpSpI作用于宿主细胞鞘氨醇的合成以减少细胞自噬[16]。在细胞自噬晚期,自噬体上的突触融合蛋白17 介导自噬体与溶酶体融合,军团菌效应蛋白Lpg1137结合并裂解突触融合蛋白17,阻止了自噬以及细胞凋亡的早期步骤[22]。近年来发现Icm/Dot 系统通过底物 MavC(Lpg2147)诱导E2酶UBE2N 的单泛素化来抑制细胞内的信号传导,调节宿主细胞的免疫[23]。

鞭毛蛋白是军团菌感染机体后激活免疫的关键。使用军团菌感染小鼠的巨噬细胞后,巨噬细胞通过Nlrc4 和Naip5检测并识别鞭毛蛋白,形成Naip5/NLR4炎性小体,进一步激活细胞内的caspase-1,导致了IL-1β与IL-18的释放,启动细胞的死亡程序。同时Toll样受体5 (Toll-like receptor 5,TLR5)也识别鞭毛蛋白,激活核转录因子κB通路导致细胞的死亡。Akhter等[24]实验观察到这一过程中伴随着细胞核中DNA 的破裂,因此这一过程为细胞焦亡,限制军团菌在体内的复制及传播。A/J小鼠在感染军团菌后可形成类似人类的军团菌肺炎模型,其原因就是该种小鼠的Naip5基因表达水平缺陷,不能引起细胞对鞭毛蛋白的识别,允许军团菌在细胞内大量复制,实验表明,鞭毛的运动能力对军团菌的毒性并没有产生影响,在敲除了fla基因之后,军团菌的鞭毛不能运动,但可使军团菌逃避巨噬细胞的识别机制,在非A/J小鼠的巨噬细胞中进行复制[25]。与小鼠不同,人类的巨噬细胞允许军团菌在其中大量复制,这可能源于人类仅表达1 个 NAIP 基因(h NAIP)[26],h NAIP 同样通过识别鞭毛蛋白来激活caspase-1通路限制军团菌的生长[27],并识别细菌T3SS中的一种针状蛋白Prgl[28],但作用不如Naip5强烈。

除了鞭毛蛋白,军团菌的脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)、dsDNA 同样可以激活细胞内的炎性小体的形成来限制其在细胞内的生存。通常人类对于细菌LPS的识别是通过TLR4进行的,但是由于军团菌的类脂A 存在很长的脂肪酸链影响了TLR4对其的识别,军团菌LPS的识别由TLR2 进行[29]。LPS 激活caspase-11 (在人类中为caspase-4),这一过程触发孔洞的形成并导致了IL-1α的分泌[30]。caspase-11/caspase-4同时促进溶酶体与LCV 的结合抑制病原体的复制[31]。但目前对于LPS是如何泄露到宿主细胞质中并激活caspase-11/caspase-4 的机制仍不清楚。军团菌dsDNA 同样可激活巨噬细胞内的炎性小体AIM2,此后激活caspase-1通路,导致细胞焦亡[32]。

3 军团菌感染后机体免疫调节机制

军团菌在进入人体后,首先激活固有免疫应答,产生对其的清除作用。单核细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞等固有免疫细胞均在这一过程中起到重要作用。这些细胞通过模式识别受体识别军团菌及被感染的巨噬细胞,并发挥免疫效应将其清除。Brown等[33]对感染了军团菌肺炎的小鼠进行肺部炎症细胞分离定量,结果提示,在感染1 d后,肺泡巨噬细胞占总炎性细胞的一小部分,到第2 天,仅占炎性吞噬细胞总量的1%,97%是单核细胞衍生细胞(monocyte-derived cell,MC)与中性粒细胞。巨噬细胞在吞噬军团菌后释放IL-1α,使肺泡上皮细胞分泌趋化因子,诱导中性粒细胞向感染部位大量募集[34]。另一项研究同样证实,小鼠在感染嗜肺军团菌72 h后促炎细胞因子大量爆发,大量的中性粒细胞与单核细胞涌入肺部[35]。

中性粒细胞在清除机体内军团菌的前期中起重要作用,但在感染48 h后,中性粒细胞的数量迅速减少[36]。中性粒细胞一方面通过活性氧的作用直接吞噬杀灭军团菌,另一方面,产生肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor,TNF)结合巨噬细胞表面的肿瘤坏死因子表面受体 (tumor necrosis factor receptor,TNFR),使巨噬细胞溶酶体与LCV 结合抑制军团菌的复制[37]。

单核细胞在被募集至感染灶后,原位分化成为MC,产生IL-12来促进细菌清除,继而刺激自然杀伤细胞和局部的记忆T细胞、自然杀伤T细胞、γδT细胞产生干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ),增强MC对细菌的杀灭。在感染进行至第3天后,MC 的数量明显增加,成为清除病原体的主力,MC通过IFN-γ的刺激,直接杀灭细菌[38],与中性粒细胞相比,MC 在肺部停留的时间更长,并且可以重新激活抗原特异性T 细胞并诱导细胞因子的分泌[39]。

自然杀伤细胞是机体感染军团菌后生产IFN-γ的主要来源,机体感染军团菌后被TLR 识别,通过MyD88依赖通路激活自然杀伤细胞产生大量IFN-γ[40],介导了对军团菌的防御作用。缺乏MyD88信号传导的小鼠无法控制军团菌在体内的复制,并会导致细菌向肝脏脾脏的传播[41]。中性粒细胞在清除军团菌期间激活caspase-1,释放IL-18,同样对自然杀伤细胞的激活起重要作用[42]。

虽然巨噬细胞在军团菌感染引起的固有免疫过程中发挥的免疫作用有限,被感染的吞噬细胞由于军团菌效应蛋白的作用,产生的TNF和IL-12水平低下,但Copenhaver等[43]的实验证明,在军团菌感染过程中,未吞噬军团菌的巨噬细胞 (旁观细胞)可以与被感染的巨噬细胞起到强烈的协同作用。感染的巨噬细胞产生IL-1α与IL-1β作用于旁观细胞的IL-1R,使旁观细胞大量释放IL-6、TNF 和IL-12,从而产生对军团菌的免疫效应。

由于在军团菌感染期间固有免疫起到决定性作用,目前对于军团菌感染期间的适应性免疫的研究并不多见。在感染前7 d,CD4+T 细胞和CTL细胞进入肺组织参与感染的清除,使用药物消耗CD4+T 细胞及CD8+T 细胞的小鼠在感染军团菌后会迅速死亡[44]。在感染3 d后纵隔淋巴结中可发现军团菌抗原特异性T 细胞,在第6天,CD4+T 细胞分化为Th1 和Th17 细胞渗透至肺部分泌IFN-γ、IL-1和IL-17辅助固有免疫[45]。

B细胞同样参与军团菌感染的适应性免疫,军团菌感染后LPS、膜蛋白、热休克蛋白等可刺激B细胞产生特异性IgG 及Ig A 抗体[46]。研究表明感染后7～10 d,在CD4+T 细胞的帮助下,肺部产生大量的记忆B细胞。但针对军团菌的特异性抗体在体内是否存在保护作用目前是存疑的,使用军团菌热休克蛋白60对小鼠进行皮下注射可导致IgG的产生,在感染最初的48 h起到了保护作用,但是在豚鼠中并未起到作用[40]。另一项使用军团菌重组A 型鞭毛蛋白(recombinant type A flagellin,r FLA)对小鼠进行免疫,再对小鼠进行致死量的嗜肺军团菌静脉注射,使用r FLA组有60%存活,结果提示rFLA 可引起小鼠的免疫应答[47],但是否可以进一步应用还有待实验。

4 军团菌肺炎造成肺损伤的原理

军团菌肺炎临床症状缺乏特异性,但常伴有消化道症状、中枢神经症状等肺外表现。军团菌感染的急性期病理改变为纤维素性化脓性肺炎和急性弥漫性肺泡损伤,常见散在小脓肿,后期肺部渗出物和透明膜机化及间质纤维化。肺血管肌型动脉常呈非坏死性血管炎改变,约1/3的患者累及胸膜,呈浆液性、浆液纤维素性或化脓性胸膜炎改变[48]。在进行小鼠的军团菌肺炎建模时发现,小鼠肺组织中存在间质炎症、大量细胞浸润、肉芽肿形成及血管周围淋巴细胞套扎,在感染48 h后出现严重的肺泡壁坏死[49]。

在免疫反应过程中,军团菌本身毒力因子、细胞因子以及白细胞产物的释放造成了急性炎症的发生。军团菌拥有革兰阴性菌中典型的抗原,包括LPS、鞭毛蛋白、热休克蛋白、外膜蛋白等,并可经淋巴和血行播散至肺外器官,引起多系统性的症状。通常LPS是导致肺部纤维渗出的主要原因,但军团菌LPS是低内毒素性和低热原性的,相对于其他革兰阴性菌,军团菌的LPS的脂肪酸链过长,使用军团菌的LPS处理细胞,细胞产生炎性因子所需要的LPS浓度是高致病性大肠杆菌的1 000倍[50],且军团菌的LPS并不能与单核细胞的LPS受体CD14相结合,因此在人体中虽可被TLR2识别,但表现为低毒性。Pil Y1是暴露于军团菌表面的一种蛋白质,与铜绿假单胞菌表面的Pil Y1高度同源[51]。Hoppe等[52]发现其与军团菌的毒力密切相关,可有效增加军团菌对细胞表面的粘附力、增强鞭毛的运动能力及生物膜的形成。军团菌感染后肺部毛细血管通透性增加,血管内皮细胞及血管内皮细胞间连接的损伤以及炎症导致肺部水肿形成[53]。

机体固有免疫在清除军团菌时产生炎性细胞因子风暴及炎性细胞浸润,从而引起炎症的产生[54]。中性粒细胞等进行不完全吞噬作用和破碎溶酶体泄漏,进入组织[55]。溶酶体内含有酸性水解酶、中性蛋白酶及溶解酶等,可降解如胶原纤维、基底膜、纤维素、弹力蛋白等细胞外成分,在化脓性炎症的组织破坏中起到重要作用。固有免疫在清除病原体的过程中会造成组织损伤,调节性T 细胞通过分泌IL-10和转化生长因子β来抑制损伤性炎症反应[56]。

在进行小鼠军团菌肺炎模型的建立过程中,感染6 d后观察到浸润性巨噬细胞的数量明显增加,血管周围的肉芽肿组织形成加重。Friedman等[57]认为是感染后分泌的IL-2、TNF等诱导了Th1细胞的免疫反应,在免疫后期活化巨噬细胞,造成了感染晚期的机化性肺炎。但目前军团菌感染造成肺部纤维化的具体机制仍不明确。有研究发现在结核分枝杆菌感染期间,HIF-1α水平的升高与肉芽组织的形成相关[58],但这种调节形式是否同样存在于军团菌感染的过程中还需要进一步的研究。

5 军团菌感染中的其他调控机制

军团菌在感染人体后的表现存在个体差异,一部分健康人在感染军团菌后并未出现严重的肺炎,而是表现为自限性的庞蒂亚克热。目前的临床研究认为,存在高危因素的患者更易患严重的军团病。针对2011-2015年欧洲军团病的调查报告显示,欧洲军团病男性的发病率更高,且随年龄的增长发病率增加,这可能与老年男性的吸烟习惯有直接关系[3]。目前认为吸烟增加了肺部对细菌感染的敏感性,影响了巨噬细胞的功能[59],但具体影响机制仍不明确。

军团菌肺炎的严重程度明确取决于宿主吸入的菌量及宿主本身的免疫状态,免疫状态低下的患者更易患严重的军团病[60]。巨细胞病毒感染、恶性肿瘤化疗及器官移植后使用免疫抑制剂期间均为感染军团菌的高危因素,在进行抗感染药物治疗时必须延长治疗时间或使用联合疗法[61]。一项针对小鼠的实验表明,脓毒血症所致免疫抑制状态易继发军团菌感染,且更易通过血运播散至脾脏、肝脏形成脓肿,这与CD4+T 细胞的增殖减少有关[62]。Lanternier等[63]证实,临床上应用TNF-α抑制剂的患者军团菌肺炎患病率明显升高。TNF和TNFR 的缺乏会严重影响军团菌肺炎的病程[64],在TNFR 基因敲除小鼠中进行肺部军团菌感染,相对于野生型小鼠肺部病变更加严重且死亡率更高,TNFR 的缺乏会导致中性粒细胞募集至肺部失败,导致细菌不能被清除[65]。免疫妥协状态的军团菌肺炎患者的病死率可高达19%,而非免疫抑制的军团菌肺炎患者的病死率为2.5%～6%[66]。因此,针对免疫妥协患者,目前推荐联合应用抗感染药物,疗程至少3周。由于军团菌是细胞内病原体,其对抗感染药物的反应时间较长,过短的治疗方案可能导致军团菌肺炎的复发[4]。

临床发现军团菌感染的患者同时可合并其他细菌的多重感染,造成治疗失败。Mizrahi等[67]使用二代测序技术对确诊军团菌感染患者的痰液进行病原体基因分析,结果在其中检出了肺炎链球菌、不动杆菌等其他病原体,且根据检出军团菌在其中占比的不同,合并感染的菌种组成是存在差异的。有研究认为军团菌易感性的差异可能与肺部微生物群的构成差异存在相关性[68]。一项针对军团菌肺炎患者治疗过程中的呼吸道标本病原体序列检测的研究表明,与健康患者相比,迁延不愈的军团菌肺炎患者肺部微生物的多样性明显下降,而且测序表明,患者对治疗的不敏感并不是因为军团菌产生耐药基因,这有可能是肺部感染期间肺泡内的儿茶酚胺水平及炎症因子变化有利于包括链球菌在内的特定菌群的生长,增加了军团菌肺炎的治疗时间及难度[69]。但具体的机制仍需进一步研究说明。

动物模型的研究表明军团菌在感染不同的小鼠品系中表现差异巨大,取决于小鼠对军团菌鞭毛识别受体的基因表达不同。因此有团队提出猜测:人类感染军团菌后的个体差异性表现是否也是由于基因多样性导致的。Hawn等[70]对一次在荷兰爆发的军团菌肺炎中的患者进行基因组学分析,提示存在TLR5终止密码杂合子的人类更容易患严重军团菌肺炎。而军团菌的不同菌株在感染哺乳动物巨噬细胞的表现上同样存在差异[71],同一血清型不同来源(临床株、环境株)的嗜肺军团菌菌株在同一种小鼠来源的巨噬细胞中的生存结果存在异常,军团菌基因的多样性也是导致宿主感染结果不同的因素之一。近期一项研究对军团菌的基因进行测序,寻找可能有效的药物靶标,对军团菌的4 358种蛋白进行分析,有18种蛋白被选为特定药物靶标,而其中11种蛋白质适合针对其开发窄谱抗生素,但具体药物开发有待进一步研究[72]。

人类感染军团菌通常是由于吸入了被军团菌污染的气溶胶,但军团菌属兼性胞内寄生菌,在环境水中可寄生于水生原生动物中,在变形虫中的寄生可能导致军团菌的毒力增强。Brieland等[73]发现,与单纯感染军团菌的小鼠相比,吸入了含有军团菌变形虫的小鼠肺组织释放的炎性因子水平升高。变形虫内生长的军团菌比在培养基上生长的军团菌毒力更强,在巨噬细胞中显现出了更强的复制能力[74]。另有研究表明,失去了毒力的军团菌突变株与变形虫共同接种至小鼠肺部后可恢复毒力[75]。虽然罕见,但临床也时有免疫抑制患者肺部变形虫感染的报道[76],需要警惕这种共同感染的情况发生。

6 总结和展望

军团菌肺炎的病死率居高不下,基础疾病以及免疫抑制的存在进一步增加了军团菌感染的机会,但这其中的具体原因及相互作用尚不明确。充分认识和理解军团菌造成肺部损伤的原因及其调控机制,对于在研究中寻找可改善军团菌肺损伤的因素是有极大帮助的,期望通过对此的研究可以解决临床上对于军团菌肺炎治疗困难的问题,对提出针对军团菌肺炎治疗的新思路提供帮助。

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