嗜肺军团菌致病机制及快速检测最新研究进展

鲁曦 李王平 李春梦 孙瑞琳 房延凤 金发光

军团菌(Legionella)在1976年被首次报道，当时在美国费城参加退伍军人聚会的老兵中有182人出现了严重的肺炎症状，147人住院，29人死亡[1]。经过密切的调查之后，发现致病菌是一种革兰氏阴性杆菌，命名为嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)[2]。自军团菌首次报道之后很短的时间内，共发现了50余种军团菌，其中至少24种与人类疾病相关。90%以上的军团病是由嗜肺军团菌导致[3]，但在某些特定条件下，免疫缺陷患者可能对任何军团菌种普遍易感。嗜肺军团菌共有15种血清型，在全世界范围内有84%的军团菌感染是由血清1型引起。一项在法国的环境与临床对比研究中发现，嗜肺军团菌血清1型占环境中军团菌的28%，但却占患者体内分离到军团菌的95%[4]。其余人类易感军团菌包括：波兹曼军团菌(Legionellamicdadei)、米克达德军团菌(Legionellamicdadei)和长滩军团菌(Legionellalongbeachae)共占人类军团菌感染的2%～7%[4]。

军团病于1982年在我国南京首次报道[5]以来，在我国成散发和小规模局部暴发，受到了我国政府和卫生部门的高度重视。因此，了解军团菌感染机制、熟悉军团菌最新的检测技术是控制军团病的关键所在。本文对该领域最新研究成果进行简要综述。

一、 嗜肺军团菌的致病机制

1. 嗜肺军团菌在真核细胞内复制的机制研究进展： 嗜肺军团菌与真核细胞的相互作用，是理解该菌致病机制的关键。一般而言，吞噬体利用细胞内吞作用形成可以被消化的囊泡，随后与溶酶体融合后通过酸化和蛋白酶的作用将大多数微生物降解消化[6]。然而，含有军团菌的囊泡(Legionellacontaining vesicles, LCV)却能够推迟与溶酶体的融合[7]。首先，通过PI-3激酶依赖(或非依赖)的方式发生军团菌内吞，形成LCV[8]，初级LCV能够推迟溶酶体融合与酸化，在内吞作用发生的5 min内，LCV开始募集内质网分泌的囊泡，这些囊泡原先是用于内质网和高尔基体之间物质交换的，在内吞作用之后的4～10 h，LCV就利用了这些囊泡中的蛋白质在pH中性的LCV中，以二分裂的方式开始复制，并突破宿主细胞[9]。在LCV形成之后的18～24 h之后才开始出现内吞作用的标志物(包括LAMP-1、组织蛋白酶D和Rab5)，而这些标志物在内吞大多数微生物之后的早期就会出现[10]。

最近研究发现，LCV能够特异的招募Rab1分子，而非Rab2和Rab6。实验发现抑制Rab1活性，能够抑制嗜肺军团菌在胞内的复制[11]；利用RNA干扰技术发现Sar1和Arf1分子敲减，也能够抑制嗜肺军团菌在胞内的复制[12]。此外某些证据表明，嗜肺军团菌对宿主细胞自噬的调控作用对其在胞内复制也十分重要，例如，与自噬有关的Atg7和Agt8表现出能够与LCV短暂的交联，这种相互作用可能是利用自噬为嗜肺军团菌的胞内复制提供营养[13]。但也存在一些相反的证据，例如自噬缺陷的宿主细胞并不影响嗜肺军团菌的复制[14]。因此，自噬对嗜肺军团菌复制的影响仍需进一步研究。

2. 嗜肺军团菌进出真核细胞的分子机制研究进展： 人们对于嗜肺军团菌如何进入真核细胞并最终释放和感染其他细胞的过程知之甚少。目前在该领域存在两种假说，其一为利用宿主传统的内吞作用进入细胞的假说：例如研究人员发现了某些哺乳动物细胞和阿米巴虫，能够通过卷吞噬作用(coiling phagocytosis)使嗜肺军团菌进入宿主，但这种机制(卷吞噬作用)发生频率很低[15]；再比如骨髓来源的巨噬细胞通过大胞饮(macropinocytosis)作用使军团菌进入宿主[16]；此外还有经典的拉链样机制和调理素依赖的吞噬机制[17]，都属于支持嗜肺军团菌利用宿主内吞作用进入细胞的证据。此外，即使像PI-3激酶介导内吞这种有较多证据、且相对成熟的机制也同样存在争议：例如最近的一项研究，利用PI-3激酶抑制剂(wortmannin)并没有显著影响巨噬细胞对嗜肺军团菌的内吞作用[18]。

第二种假说是毒力因子介导的侵袭作用：其证据包括非吞噬细胞中的实验，例如A549， CHO-K1和HeLa细胞实验均支持这一假说[19-21]。目前已发现有5种蛋白与嗜肺军团菌侵袭相关，他们分别是EnhC、LpnE、RtxA、LvhB2和HtpB，其中研究得相对透彻的是HtpB蛋白，当嗜肺军团菌进入宿主细胞形成LCV之后，HtpB蛋白在宿主细胞和LCV中表达上调[22]。最新研究结果表明HtpB对于募集线粒体至初始LCV的过程中起到了关键作用[23]。

3. 嗜肺军团菌基因组： 截至作者发稿(2017年12月)，已有67株嗜肺军团菌基因组被完整测序， GC%介于38.1%～38.6%，基因组大小介于2.68M～3.78M、预测基因数量介于2 945～3 512个。根据生物信息学比对分析，发现不同嗜肺军团菌基因组中有80%左右的基因同源，只有10%左右的基因为菌株特异性。研究发现，这些菌株特异性基因组区域的GC含量与全基因组平均GC含量存在较大差异，例如费城1型株特异性基因组到包含一个trb/tra区域和若干外排泵基因[24]。推测这些区域可能是通过种间的基因水平传播获得[25]。而对于嗜肺军团菌的核心区域编码，基本与感染宿主、复制等过程相关，这些核心区域高度保守[26]。系统进化树分析发现，嗜肺军团菌共有四大谱系，但各种谱系与菌株分离的地理位置以及流行性并不相关[26-27]。以上实验说明嗜肺军团菌具有高度多样性，目前难以从基因组水平判断某种嗜肺军团菌的感染能力。

4. 嗜肺军团菌毒力因子研究进展： 嗜肺军团菌不仅具有多种传统的细菌毒力因子，例如脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、鞭毛(flagellum)、Ⅱ型分泌系统和外膜蛋白等，还能够利用Dot/Icm Ⅳ型分泌系统向真核宿主细胞内传递将近300种效应蛋白，并影响宿主生理活动。下面对这种嗜肺军团菌特有且具有十分重要的分泌系统的研究进展进行简要概述。

目前研究发现，Dot/Icm Ⅳ型分泌系统组分几乎参与了胞内生存嗜肺军团菌的各种生理活动，例如嗜肺军团菌进出宿主细胞、胞内复制、LCV形成、甚至能够抑制宿主细胞凋亡。该系统分为两个致病域，其中Ⅰ区由dotDCB和dotA-icmVWX基因编码[28]，Ⅱ区由18个不同型的dot和icm基因编码[29]。Dot/Icm Ⅳ型分泌系统组成的跨膜蛋白在嗜肺军团菌表面形成一种类似菌毛的结构，能够插入宿主细胞质膜和LCV膜进而传送多种效应蛋白。例如LidA，作为该分泌系统最早鉴定的效应分子，与Rab的捕获识别相关，能够识别包括Rab1、Rab6和Rab8在内的多种Rabs[30-31]。SidM分子能够专一性识别Rab1分子，具有3个结构域，其中N端结构域负责修饰Rab1，C端参与该分子与LCV膜的锚定作用[32-33]。总之，Dot/Icm Ⅳ型分泌系统在利用宿主细胞调控囊泡转运、形成LCV，进而逃避降解、抑制宿主细胞凋亡并参与复制中均起到了关键性作用。

5. 嗜肺军团菌感染的免疫应答

(1) 嗜肺军团菌感染的固有免疫应答： 军团菌感染的各种动物模型中发现豚鼠对嗜肺军团菌易感，气溶胶暴露3 d即可出现军团菌感染的症状[34]，但是绝大多数小鼠却对除长滩军团菌(L.longbeachae)之外的军团菌产生天然抵抗，而这为研究对军团菌的免疫应答提供了有利条件。研究发现对军团菌高度抵抗的C57BL6小鼠13号染色体中lgn1位点存在一系列高度多态性的重复序列，其中包括神经元细胞凋亡蛋白(Naip)，和棒状病毒IPA(Birc1)都与嗜肺军团菌易感性相关[35-37]。Naip5是一种细胞内鞭毛蛋白识别分子,一旦巨噬细胞吞嗜肺军团菌，Naip5会立刻激活caspase-1，进而导致IL-1β产生，并促进LCV与溶酶体融合，最终将嗜肺军团菌降解[37]。同时发现Naip5的敲除能够逆转对嗜肺军团菌在细胞内复制的限制作用[38-39]。一项最新的研究发现，MyD88，一种Toll样受体的配体分子的敲除，能够增加小鼠肺内嗜肺军团菌载量，降低嗜肺军团菌感染小鼠的生存率[40]。

虽然小鼠感染模型研究已比较透彻，但是对人感染嗜肺军团菌的固有免疫应答仍知之甚少。在一项回顾性分析研究中发现，嗜肺军团菌感染患者的IFN-γ水平比非军团菌感染患者低[41]，提示IFN-γ产生能力降低，与嗜肺军团菌的易感性相关。军团菌感染后宿主细胞以释放Th1型细胞因子以限制军团菌的复制[42]。此外对于军团菌易感人群的研究中发现，TLR多态性是军团菌感染的独立风险因素，TLR5在392位为终止密码子的TLR5392STOP型在人群中的比例大约为10%，但军团菌易感性却显著高于其他类型TLR5的人群[43]。

(2)嗜肺军团菌感染的适应性免疫： 尽管多种炎症反应对于机体控制军团病的进展十分重要，但是T细胞和B细胞对于清除感染依然不可或缺。例如：在小鼠体内的研究发现，利用CD5或CD8 T细胞的单克隆抗体处理小鼠，能够降低嗜肺军团菌感染小鼠的生存率，并且会极大的加速感染模型中军团菌的清除时间[44]，然而，对于上述免疫细胞如何被激活并产生保护作用的具体机制仍然知之甚少。小鼠骨髓来源的树突细胞或巨噬细胞被嗜肺军团菌感染后能够刺激CD4 T细胞产生IFN-γ，同时发现 CD4 T细胞的激活有赖于LCV的形成并且抑制与溶酶体的融合作用[45]。以上结果提示，虽然宿主内的嗜肺军团菌存在于LCV中，但依然能够为CD4 T细胞提成抗原。例如，感染嗜肺军团菌的小鼠，DC细胞能够上调CX3CL1趋化因子，进而诱导T细胞激活[46]。

在人类嗜肺军团菌感染的研究中已证实存在细胞介导的免疫反应，但成果有限。根据临床观察发现，接受激素治疗和艾滋病，以及某些类型的血液疾病是罹患军团菌病的风险因素[47]。

二、 嗜肺军团菌检测技术进展

1. 传统微生物培养法： 军团菌的分离培养是军团病确诊以及流行病学研究的金标准，该方法是利用了嗜肺军团菌在GVPC和BCYE琼脂平板上生长，但在L-半胱氨酸缺失的BCYE琼脂平板上不生长这一特点，再经进一步生化试验和血清学实验进行确认的技术。菌落一般呈灰白色，偶见紫色或蓝绿色。虽然该方法检测周期长，不利于现场快速诊断，但该技术结果可靠，而且对于获得军团菌完整信息，例如研究其基因背景、耐药性或分子分型依然十分必要。

2. 免疫学检测技术： 抗体检测：患者体内特异性IgM能够作为军团菌感染的早期诊断依据，常用的检测方法包括间接凝血实验(indirect hemagglutination, IHA)、酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、微量凝集实验(micro agglutination experiment, MAT)等，其中IHA可以诊断嗜肺军团菌1-4型血清型的抗体；ELISA用于检测军团病疑似患者体内特异性IgG水平，常用于流行病学回顾性分析[48]。虽然免疫学检测受限于患者免疫状态，并且存在与其他病原体交叉的情况，尤其是难以对急性感染和既往感染进行鉴别，不过，抗体检测技术操作简便，目前仍在使用。

抗原检测：通过对疑似患者呼吸道分泌物进行直接免疫荧光检测，能够快速特异的检测，但该技术灵敏度低，与某些致病菌(例如铜绿假单胞菌)存在交叉反应。此外，尿抗原是临床上常用的军团菌检测方法，该方法检测靶点为军团菌细胞壁的热稳定性LPS。由于军团菌尿抗原会在感染后1 d即可检出并持续若干天，目前已有多种尿抗原检测产品评价的论文发表[49]。该技术操作简单，样本易获取，可用于早期诊断，但该技术目前只能对嗜肺军团菌1型血清型进行检测，且成本较高。

3. 基于脂肪酸检测技术进展： 脂肪酸分型技术是根据微生物短链脂肪酸(C9-C10)种类和含量的特异性与多样性，利用气相色谱仪对微生物短链脂肪酸进行鉴定，并与数据库进行比对，从而快速准确的对微生物进行鉴定和分型的新技术[50]。目前该技术获得美国CDC和FDA认证，具有较高的应用价值。但该方法只能对分离得到的菌株进行检测，而无法对环境或临床样本直接检测。

4. 核酸水平检测技术进展

(1)基于PCR的检测技术： PCR是一种可靠的核酸扩增技术，对于嗜肺军团菌，常利用mip基因和16S rRNA作为靶基因进行检测，mip基因具有嗜肺军团菌种特异性；而16S rRNA基因不仅可以用于嗜肺军团菌的特异性检测，而且能够对军团属进行鉴别[51]。目前常用荧光定量PCR对临床及环境样本直接检测，具有快速灵敏的特点，而且是目前除分离培养技术之外唯一被写入标准技术规范的检测方法。

(2) 基于等温扩增的检测技术： 等温扩增技术也属于核酸扩增技术，种类较多、发展迅速。由于扩增温度恒定而不需要依赖PCR仪，具有简便、快速、灵敏的特点更加适用于现场快速检测，目前主流技术包括NASBA、HAD、RCA和LAMP技术。由于LAMP技术成本较低，目前国内外多家体外诊断试剂公司已成功开发除军团菌检测试剂盒并上市。虽然等温扩增技术原理复杂，但是操作简单，有利于推广应用[52]。

(3)基于探针杂交的检测技术进展： 利用探针杂交技术应用于军团菌的检测，具有一定前景，由于可将探针连接在芯片上从而实现高通量检测，同时不仅能够对军团菌的属、种进行鉴定和鉴别，同时还能够了解军团菌的毒力基因和耐药基因等遗传背景信息。该技术的高通量特点极大节省了人力，但由于操作复杂，依赖复杂的仪器设备和人员数据处理能力，目前尚未普及。

(4)基于二代测序的检测技术进展: 二代测序是相对于焦磷酸法测序(一代)而言的高通量测序技术，目前市场上主流使用的是Illumina公司生产的各型号测序平台以，而罗氏公司的454测序仪已经退出市场。二代测序平均读长约为几百bp，可以通过提高测序深度达到提高分辨率和灵敏度的目的。二代测序的问世极大降低了每个碱基测序成本，为深入进行军团菌的基因组、转录水平研究提供了有力工具[53]。此外基于16S的测序也为嗜肺军团菌所处环境的菌群研究提供了技术保证。

虽然嗜肺军团菌属于环境微生物，但它能够在真核细胞内复制，并且逃避宿主免疫系统攻击而导致严重的肺炎。随着高通量测序技术的推广，越来越多军团菌菌种以及它们的毒力因子和效应蛋白被发现，极大地加深了人们对该物种的了解，提高了对嗜肺军团菌胞内复制、毒力分泌和侵袭的认识。这必将有助于人们理解嗜肺军团菌的进化方式和流行病学特征，也必将有助于开发新型军团菌检测技术和军团病的治疗方法，对于控制嗜肺军团菌在人群中的爆发和传播提供有力保障！

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