UPLC法测定川芎定痛胶囊中四种成分

佟彬良 吴梦琦 颜文 赵梦然 杨树民 张卓 秦荣飞 周春华

川芎定痛胶囊为河北医科大学第一医院生产的中药复方制剂，其由川芎、绞股蓝、延胡索、白芷、细辛、全蝎等6味药材组成，主要含有机酸类、生物碱类、香豆素类、三萜皂苷及大量挥发油等活性成分，主要有平肝熄火、调和气血，通络止痛之功效，主要用于偏头痛、紧张性疼痛、丛集性头痛不伴外感症状者，临床应用疗效确切[1]。君药川芎具有活血行气、散瘀止痛、祛风燥湿的功效[2]，川芎中绿原酸、阿魏酸具有抗炎、抗氧化活性以及保护神经等药理作用[3]。君药全蝎平肝熄风，入络搜风止痛[4]。臣药绞股蓝具有降血脂、调血糖、增强免疫、抗炎、护肝、抗氧化、保护心脑血管、抗肿瘤等药理活性[5]。臣药延胡索主要有镇痛、活血、理气之功效，其中延胡索乙素主要有镇痛、镇静等药理作用[6]。佐药白芷芳香行气止痛[7]，其中欧前胡素具有解热镇痛、抗菌抗炎、血管舒张等药理作用[8]。佐药细辛有祛风散寒、通窍止痛、温肺化饮之功效[9]。目前川芎定痛胶囊的质量内控标准只有川芎、绞股蓝的定性鉴别和绞股蓝皂苷的分光光度法的定量分析实验，还缺乏对多个有效成分的进行含量测定的方法。川芎定痛胶囊中单味药材的质量控制仅有少量报道，且仅停留在对部分成分的含量测定上，缺少对产品有效成分的整体评价，无法全面有效控制药品质量[10-14]。因此，本研究建立并应用UPLC法同时测定川芎定痛胶囊中四种有效成分的含量，为其质量标准的完善提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 试药:川芎定痛胶囊，河北医科大学第一医院自制，批号为170923，180725，190301，191013，批准文号：冀药制字Z05000005；绿原酸(Chlorogenic acid，批号：Y24J7K16726)，阿魏酸(Ferulic acid，批号：H27J7L16718)，延胡索乙素(Rotundinum，批号：Y21S7Y17091)，欧前胡素(Imperatorin，批号：P02J9F64791)，均购自上海源叶生物科技有限公司，以上对照品纯度均>98%。

1.1.2 仪器:ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色谱仪，配有四元溶剂管理器、柱温箱、自动进样器、紫外检测器(TUV)及Empower色谱工作站(美国Waters公司)，由美国沃特世公司生产。

1.2 测定条件与溶液制备

1.2.1 色谱条件:色谱柱：HSS C18柱(2.1×150 mm，1.8 μm)；柱温：35℃；流动相：0.2%乙酸(A)-乙腈(B)；流速：0.3 ml/min；检测波长：254 nm；进样量：2 μl；梯度洗脱：5%B预平衡10 min，0～10 min：5%～14%B，10～20 min：14%～25%B，20～25 min：25%～30%B，25～35 min：30%～55%B，35～45 min：55%～95%B，45～46 min：95%B，46～47 min：95%～5%B。

1.2.2 对照品溶液的制备:分别精密称取绿原酸、阿魏酸、延胡索乙素和欧前胡素对照品适量，加50%甲醇制得混合对照品溶液，于4℃冰箱保存，稀释浓度依次为12.01、10.06、674.31、38.13 μg/ml。

1.2.3 样品溶液的制备:将10粒川芎定痛胶囊内容物混匀，精密称取0.5 g，置具塞量瓶中，精密加入50%甲醇10 ml，称重，超声处理40 min，放冷，再称重，以相同溶剂补足重量差，摇匀，滤过，即得。

1.3 方法学考察

1.3.1 专属性:以前述UPLC方法分析溶剂空白溶液，川芎定痛胶囊样品溶液，含有绿原酸、阿魏酸、延胡索乙素、欧前胡素的混合对照品溶液，考察各成分的色谱分离情况。

1.3.2 标准曲线与定量下限:以50%甲醇稀释含有绿原酸、阿魏酸、延胡索乙素、欧前胡素的混合对照品溶液，得系列不同浓度标准溶液，绿原酸、阿魏酸、延胡索乙素和欧前胡素分别在2.40～12.01、2.01～10.06、134.86～674.31、7.63～38.13 μg/ml，采用已建立的UPLC方法检测，以分析物浓度(x，μg/ml)与峰面积(y)为横纵坐标进行线性回归。以信噪比10∶1确定定量下限。

1.3.3 回收率:按照前述样品溶液制备方法，取批号为180725的川芎定痛胶囊内容物，制备加入混合对照品的样品溶液共六份，其中分别精密称取0.25 g，分别精密加入混合对照品溶液，以前述方法采用已建立的UPLC方法检测，计算绿原酸、阿魏酸、延胡索乙素、欧前胡素的加样回收率及相对标准偏差(RSD)值。

1.3.4 精密度:按照前述样品溶液制备方法及所建立的UPLC方法，配制一份批号为180725的川芎定痛胶囊样品溶液连续进样6次，连续测定3 d，记录峰面积，计算绿原酸、阿魏酸、延胡索乙素、欧前胡素的日内和日间RSD值。

1.3.5 重复性:按照前述样品溶液制备方法及所建立的UPLC方法，配制6份批号为180725的川芎定痛胶囊样品溶液进样分析，记录峰面积，计算绿原酸、阿魏酸、延胡索乙素、欧前胡素的含量RSD值。

1.3.6 稳定性:按照前述样品溶液制备方法及所建立的UPLC方法，分别于0、2、4、6、8、10 h对批号为180725的川芎定痛胶囊样品溶液进样测定，计算绿原酸、阿魏酸、延胡索乙素、欧前胡素的峰面积RSD值。

2 结果

2.1 色谱条件优化 液相色谱条件通常考察如流动相组成、柱温、检测波长、提取溶剂的配比等影响分离的重要因素。为了获得较高的色谱分离效率及提高化合物峰型的对称性，本实验主要从流动相组成、柱温、检测波长三方面对色谱分离条件进行优化。

2.1.1 流动相组成：对流动相中有机相和水相的组成进行调整，在流动相中加入一定的酸以改善峰形，设置四个不同比例有机相，0.2%乙酸-(50%乙腈+50%甲醇)、0.2%乙酸-甲醇、0.3%乙酸-乙腈、0.2%乙酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈、0.1%甲酸-乙腈，纯水-乙腈，从川芎定痛胶囊内容物样品的色谱图可分析，0.2%乙酸-乙腈时洗脱效果较好，峰型对称性增强，分离度好；与甲醇相比，乙腈作为有机相，压力较低、洗脱能力较强，故选择使乙腈为有机相。因此，选择0.2%乙酸-乙腈为流动相进行梯度洗脱。见图1。

图1 不同流动相考组成条件下测定川芎定痛胶囊内容物样品的色谱图(a 0.2%乙酸-(50%乙腈+50%甲醇)，b 0.2%乙酸-甲醇，c 0.3%乙酸-乙腈，d 0.2%乙酸-乙腈，e 0.1%乙酸-乙腈，f 0.1%甲酸-乙腈，g 纯水-乙腈)

2.1.2 柱温：考察温度分别为30℃、35℃、40℃，根据不同温度下川芎定痛胶囊内容物样品的色谱图可分析得出，当柱温为35℃时，洗脱效果好，峰对称性增强，因此选择柱温35℃进行下一步测定。见图2。

图2 不同柱温条件下测定川芎定痛胶囊内容物样品的色谱图(30℃-下、35℃-中、40℃-上)

2.1.3 检测波长：川芎定痛胶囊所含成分结构类型复杂，参考不同结构类别成分的吸收波长，考察波长分别为205、254、280、320 nm，根据不同检测波长条件下川芎定痛胶囊内容物样品的色谱图对比分析可得，当检测波长为254 nm时，样品峰响应值较好，灵敏度好，因此选择检测波长254 nm进行测定。见图3。

图3 不同波长下测定川芎定痛胶囊内容物样品的色谱图；(a 320 nm,b 280 nm,c 254 nm,d 205 nm)

2.2 方法学考察

2.2.1 专属性:通过比较川芎定痛胶囊样品、混合对照品与空白溶液的典型色谱图，各检测物成分的色谱峰无杂质干扰，峰形良好，保留时间稳定。见图4。

图4 川芎定痛胶囊样品(上)、混合对照品(中)与空白溶液(下)的典型色谱图;1 绿原酸; 2 阿魏酸; 3 延胡索乙素; 4 欧前胡素

2.2.2 标准曲线与定量下限:以UPLC检测混合对照品溶液中不同浓度分析物的峰面积，再与其浓度进行线性回归，结果表明，绿原酸、阿魏酸、延胡索乙素和欧前胡素的线性关系良好(R2≥0.999)。四个成分的定量下限范围在0.0027～0.152 μg/ml。见表1。

表1 测定川芎定痛胶囊中四个成分的线性回归方程

2.2.3 回收率:测定川芎定痛胶囊加入混合对照品后处理的样品溶液，如表2中结果表明方法回收率良好，川芎定痛胶囊中绿原酸、阿魏酸、延胡索乙素、欧前胡素的回收率在95.62%～102.67%，RSD在2.33%～3.19%。见表2。

2.2.4 精密度:连续3 d测定同批次川芎定痛胶囊样品溶液，结果表明仪器精密度良好，川芎定痛胶囊中绿原酸、阿魏酸、延胡索乙素、欧前胡素的日内日间精密度RSD值范围分别在0.89%～1.43%、1.37%～1.96%。见表2。

表2 测定川芎定痛胶囊中四个成分的精密度与回收率结果

2.2.5 重复性:测定6份同一批号川芎定痛胶囊样品溶液，结果川芎定痛胶囊中绿原酸、阿魏酸、延胡索乙素、欧前胡素的含量RSD值范围在1.16%～1.66%，表明方法重复性良好。

2.2.6 稳定性:测定放置不同时间的川芎定痛胶囊样品溶液，结果川芎定痛胶囊中绿原酸、阿魏酸、延胡索乙素、欧前胡素的色谱峰面积RSD值范围在1.18%～1.53%，表明川芎定痛胶囊样品溶液在10 h内稳定。

2.3 方法应用 取4批川芎定痛胶囊样品，以上述方法进行样品制备及样品测定，记录色谱图，以标准曲线法对不同批次川芎定痛胶囊中绿原酸、阿魏酸、延胡索乙素、欧前胡素的含量进行计算分析。见表3。

表3 川芎定痛胶囊中四种成分含量测定结果 mg/g

3 讨论

河北医科大学第一医院研制的中药复方制剂川芎定痛胶囊由川芎、绞股蓝、延胡索、白芷、细辛、全蝎等6味药材组成，成分复杂，临床疗效确切。目前质量内控标准只有川芎、绞股蓝的定性鉴别和绞股蓝皂苷的分光光度法的定量分析实验，无其他有效成分的含量测定。川芎定痛胶囊中单味药的质量控制只有少量报道，且仅仅停留在对小部分成分的含量测定上，因此缺少对本中药复方制剂有效成分的整体评价。由于川芎定痛胶囊为复方制剂，成分组成多样，十分复杂，有必要将多种有效成分进行整体系统研究。

根据中药复方君臣佐使原则选择典型的指标性成分对复方制剂进行质量控制具有重要意义[15-17]。川芎定痛胶囊之君药川芎中绿原酸、阿魏酸为代表成分，臣药延胡索中延胡索乙素为代表成分，佐药白芷中的欧前胡素为代表成分，因此，参考中药复方君臣佐使配伍原则，选择四个典型代表成分进行质量控制方法研究十分必要，能够进一步更加准确对有效成分进行定性定量。

UPLC法具有快速、灵敏、节省溶剂、峰容量高、分析效率高等特点，近年来越来越多的应用于中药复杂成分的分析[17-22]。川芎定痛胶囊所含成分复杂多样，因此，本研究采用了UPLC方法，分别从流动相组成，检测波长，温度对色谱分离条件进行优化，由于检测指标绿原酸与阿魏酸为有机酸类成分，为防止此类成分在色谱中拖尾现象，在流动相中加入了不同比例的酸，以改善峰形，经过实验测定，可知在色谱条件流动相组成：0.2%乙酸水-乙腈，流动相梯度洗脱，温度为35℃时，峰形良好，分离度高。另外，对样品提取溶剂进行考察，分别为20%、50%、70%、100%甲醇-水，根据不同浓度的提取溶剂处理的川芎定痛胶囊内容物样品的色谱图可分析得出，其中当提取溶剂为50%甲醇-水时，提取效果最佳，因此本实验利用50%甲醇-水对川芎定痛胶囊内容物进行提取。

本研究建立了UPLC方法测定川芎定痛胶囊中四种化学成分。对建立的方法进行了专属性、线性、定量限、检测限、回收率、精密度、重复性、稳定性等方法学验证。在47 min内绿原酸、阿魏酸、延胡索乙素、欧前胡素四种化合物分离完全，各分析物在测定浓度范围内线性关系良好，相关系数>0.999，平均回收率>80%，由此证明，该方法良好，可对川芎定痛胶囊中的四种典型成分进行定量。

综上，本研究建立的UPLC方法简单、灵敏、稳定，可用于川芎定痛胶囊四种典型成分绿原酸、阿魏酸、延胡索乙素、欧前胡素的含量测定，可为其质量控制研究提供实验性依据，进一步为其质量标准的完善提供科学依据，进而提高其临床用药的安全性和有效性。