PTEN、MMP-2、AKT在乳腺癌组织中的表达及相关性分析

周虹 钱金锋 杨其昌 张晓娟 桑秋霞

乳腺癌是发生于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，手术联合放化疗是其主要方法，早期诊断是保证治疗效果的关键。肿瘤的发生发展与致癌基因、抑癌基因相关，PTEN-P13K/AKT通路的异常活化可能参与了乳腺肿瘤细胞增殖分化过程[1]。PTEN是惟一具有磷酸酶活性的一种抑癌基因，基质金属蛋白酶-2(MMP-2)为一种细胞外基质蛋白降解酶，蛋白激酶B(AKT)是原癌基因C-AKT蛋白表达产物，为调节细胞增殖转录的重要信号通路[2,3]。本文采用免疫组化的方法，分析PTEN、MMP-2、AKT在乳腺癌组织的表达，分析PTEN与MMP-2、AKT的相关性，旨在为乳腺癌早期诊断及预后判断提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2014至2015年乳腺癌手术患者76例，年龄29～77岁，中位年龄50岁；病理类型：浸润性导管癌65例，其他11例。Elston和Ellis组织学分级[4]：Ⅰ级12例，Ⅱ级41例，Ⅲ级23例；肿瘤直径：<3 cm 44例，≥3 cm 32例；发生淋巴结转移28例，未发生淋巴结转移48例。所有患者经病理确诊、有完整的手术及随访病例资料(且术前未进行放化疗)。同期选择乳腺增生、乳腺纤维腺瘤31例为乳腺良性病变组，年龄35～68岁。

1.2 方法 所有乳腺组织标本均常规中性甲醛溶液固定、石蜡包埋、4 μm切片。切片经二甲苯脱蜡、乙醇水化；0.01 mmol/L枸楷酸盐缓冲液热修复，采用免疫组化S-P法，免疫组织化学染色，DAB/H2O2显色，苏林精对比染色，用前列腺增生组织切片为阳性对照，PPS代替一抗为阴性对照组。PTEN(单抗1∶20)，MMP-2(单抗1∶30)，AKT(多抗1∶30)。PTEN、MMP-2单抗购自Dako公司，AKT多抗购自美国CST公司。

1.3 阳性结果判断 采用10高倍镜视野观察细胞膜、细胞质着色情况，参照郭绍文等[5]文献资料，根据着色深度(0～3分)、着色阳性细胞百分比(0～3分)，以着色深度×着色百分比≥3分作为阳性表达判断标准。

1.4 统计学分析 应用SPSS 21.0统计软件，PTEN、MMP-2、AKT表达等为计数资料采用χ2检验或秩和检验，PTEN与MMP-2、AKT相关性使用Pearson分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蛋白表达情况 PTEN主要定位乳腺癌细胞及上以细胞质中，偶尔也见表细胞膜与核膜。MMP-2主要定位于肿瘤细胞质，也可表达于细胞膜与细胞核中。AKT表达于细胞核。见图1～12。

图1 PTEN在乳腺癌组织中阳性表达(SP×200)图2 PTEN在乳腺癌组织中阴性表达(SP×200)图3 PTEN在乳腺良性病变组织中阳性表达(SP×200)图4 PTEN在乳腺良性病变组织中阴性表达(SP×200)

图5 MMP-2在乳腺癌组织中阳性表达(SP×200)图6 MMP-2在乳腺癌组织中阴性表达(SP×200)图7 MMP-2在乳腺良性病变组织中阳性表达(SP×200)图8 MMP-2在乳腺良性病变组织中阴性表达(SP×200)

图9 AKT在乳腺癌组织中阳性表达(SP×200)

2.2 PTEN、MMP-2、AKT表达 乳腺良性病变组PTEN阳性表达高于乳腺癌组，MMP-2、AKT阳性表达低于乳腺癌组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 乳腺癌组与乳腺良性病变组PTEN、MMP-2、AKT阳性表达比较 例

2.3 PTEN、MMP-2、AKT表达与乳腺癌临床病理特征的关系 不同年龄、病理类型乳腺癌PTEN、MMP-2、AKT阳性表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)；高组织学分级、肿瘤直径≥3 cm、有淋巴结转移、生存期<5年乳腺癌组织，PTEN阳性表达低于低组织学分级、肿瘤直径<3 cm、无淋巴结转移、生存期≥5年组,差异均有统计学意义(P<0.05)，MMP-2、AKT阳性表达高于低组织学分级、肿瘤直径<3 cm、无淋巴结转移、生存期≥5年组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同病理特征乳腺癌PTEN、MMP-2、AKT表达 例

2.4 乳腺癌PTEN表达与MMP-2、AKT相关性 Pearson相关性分析表明，PTEN表达与MMP-2、AKT表达呈负相关性(r=-0.634,-0.512,P<0.05)。见表3。

表3 乳腺癌PTEN表达与MMP-2、AKT的相关性 例

2.5 生存曲线分析 76例乳腺癌患者中，随着时间延长，生存率呈下降趋势。3年、5年生存率分别为77.63%、53.96%。见图13。

图13 76例乳腺癌5年生存率曲线图

3 讨论

乳腺癌终生发病风险高达5%[6]，2018年全球新发乳腺癌208.8万，死亡62.7万[7]，我国新发乳腺癌近30万，死亡超过8万[8]。乳腺癌的发生发展是一个多基因参与、多环节联动、多步骤变化的复杂过程[9]，寻找有效的分子学标志物，对于早期诊断治疗及预后判断至关重要。

PTEN能靶向调节蛋白磷酸化抑制细胞生长，阻滞细胞周期于G0/G1期[10,11]。AKT通路是调节细胞增殖的重要信号通路，AKT各种因素刺激后会活化为细胞存活因子，可通过磷酸化、激活己糖激酶、降解Caspase-8活性等多种途径抑制细胞凋亡[12]。如果PTEN阳性表达缺失，则可激活PIP-3/AKT信号通路，促进肿瘤细胞浸润转移[13,14]。本文研究中，乳腺癌组织PTEN阳性表达42.11%低于乳腺良性病变组87.10%，乳腺癌组织AKT阳性表达55.26%高于乳腺良性病变组织19.35%，且不同组织学分级、肿瘤直径、有无淋巴结转移、生存期乳腺癌组织PTEN、AKT阳性表达差异均有统计学意义(P<0.05)。与梁法清等[15]文献报道基本相似，说明乳腺癌患者PTEN抑癌基因明显缺失，可能导致AKT过度表达。

基质金属蛋白酶是由Ca2+、Zn2+等组成的一组金属离子内肽酶，几乎能够降解细胞外基质各种蛋白成分[16]。MMP-2底物是位于细胞穿透基质突出部位的Ⅳ型胶原，能似“钻头”般破坏网架结构，降解细胞间基质成分及基底膜Ⅳ型胶原，打通肿瘤细胞侵袭转移通道[17]。研究表明，MMP-2是与乳腺癌关系最为密切的基质金属蛋白酶，其表达水平与乳腺癌浸润生长、侵袭转移呈正相关性[18]。本文中，乳腺癌组织中MMP-2阳性表达59.21%高于乳腺良性病变组，且不同组织学分级、肿瘤直径、有无淋巴结转移、不同生存期乳腺癌阳性表达比较均有统计学意义，李林株等[19]在分析乳腺癌中(140例)、癌旁组织(140例)中也有类似的文献报道，说明MMP-2异常表达与乳腺癌恶性生物学行为密切相关。

进一步分析表明，组织学分级越高、肿瘤直径越大、发生淋巴结转移、生存期越短，PTEN阳性表达越低，与之相反的是，MMP-2、AKT阳性表达越高。采用Pearson相关性分析表明，PTEN表达与MMP-2表达为负相关性(r=-0.634,P<0.05)，与AKT表达呈负相关性(r=-0.512,P<0.05)。可能与PTEN蛋白表达缺失负向调节AKT信号通路、AKT信号通路激活又能上调MMP-2表达等因素有关[20]。

综上，PTEN表达缺失可能通过负向调节PI3K/AKT信号通路，诱导AKT、MMP-2过度表达，共同参与乳腺癌发生发展过程。进一步研究PTEN在乳腺癌中低表达的机制，探索激活PTEN表达的方法进而抑制或阻断PI3K/AKT信号通路，可作为治疗乳腺癌提供新思路。