基于癌症基因组图谱数据库分析芳香烃受体核转运体样2在肺腺癌中的表达及其预后意义

陈金花 赵秋荣 尤剑彬 陈发林

福建省立医院检验科，福建福州 350001

肺癌是目前全球最常见的恶性肿瘤之一。据统计，2020年全球新发肺癌患者数约为220 万，占所有肿瘤诊断数的11.4%左右，因肺癌致死的病例数约为180 万，占所有肿瘤死亡人数的18.0%左右[1]。肺腺癌是一种恶性上皮肿瘤，有腺样分化和黏液分泌两种类型，目前已成为最常见的肺癌病理类型[2-3]。

有研究[4]结果显示，时钟基因与多种疾病的发生、发展密切相关。在亚细胞和分子水平上，中枢和外周生物钟由昼夜节律基因的芳香烃受体核转运体样2（aryl hydrocarbon receptor nuclear transporter-like 2，ARNTL2） 基因、Cry1 基因、Cry2 基因等共同组成。ARNTL2 是一种螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）转录因子并且已经被证明与多种转录因子具有协同作用，其中包括缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1 subunit α，HIF-1α） 和核心昼夜节律转录因子[5-6]。近年来研究表明，时钟基因ARNTL2 与肿瘤的侵袭性和转移有关[7]，在乳腺癌[8]、肝癌[9]和结肠癌[10]细胞中呈高表达，且与患者预后有关。但是，ARNTL2 在肺腺癌中是否发挥作用和肿瘤发生发展中的关系有待进一步研究。因此，本研究通过癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库下载肺腺癌组织及癌旁组织RNA seq 数据及对应的肺腺癌患者临床数据，旨在探究ARNTL2 在肺腺癌中的表达及其与肺腺癌患者预后的关系，为进一步研究ARNTL2 在肿瘤的发生发展中的作用机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 TCGA 数据下载

从TCGA数据库（https：//cancergenome.nih.gov/）下载2021年3月前肺腺癌相关的RNA seq 数据及对应的肺腺癌患者临床资料，共纳入337 例肺腺癌组织（肺腺癌组）与59 例癌旁组织（癌旁对照组）。

1.2 研究方法与观察指标

采用R 软件3.6.2 版本将基因表达数据归一化处理后进行log2 转化，提取肺腺癌组与癌旁对照组的ARNTL2 表达量用于后续分析。通过R 软件的“survival”软件包进行生存分析，使用“survminer”软件包绘制生存曲线。

①比较肺腺癌组与癌旁对照组的ARNTL2 表达量。②根据ARNTL2 表达量中位值将肺腺癌患者分为高表达组（＞8.59，91 例）和低表达组（≤8.59，246 例），单因素分析ARNTL2 表达量与肺腺癌患者临床特征（年龄、性别、Stage 分期以及TNM 分期）的相关性。③分析肺腺癌患者的生存预后关系。④单因素分析ARNTL2 表达量及临床特征（年龄、性别、Stage 分期以及TNM 分期）与肺腺癌患者预后（中位生存时间）的相关性。⑤通过Cox 比例风险模型进行多因素分析，判断影响肺腺癌患者预后的独立危险因素。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验；采用Wilcoxon 秩和检验分析ARNTL2 在分析肺腺癌组织与癌旁组织样本中的表达；生存分析采用Kaplan-Meier 生存曲线评估；通过Cox 比例风险模型进行多因素分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌组与癌旁对照组ARNTL2 表达量的比较

ARNTL2 在肺腺癌组中的表达高于癌旁对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

图1 肺腺癌组与癌旁对照组ARNTL2 表达量的比较

2.2 ARNTL2 表达量与肺腺癌患者临床特征的单因素分析

单因素分析结果显示，肺腺癌患者的年龄、Stage分期和N 分期是影响ARNTL2 表达的相关因素（P＜0.05）（表1）。

表1 ARNTL2 表达量与肺腺癌患者临床特征的单因素分析[n（%）]

2.3 肺腺癌患者的生存预后分析

肺腺癌患者的生存预后分析结果显示，ARNTL2表达与肺腺癌患者总生存期存在相关性（P=0.001）（图2）。

图2 肺腺癌患者的生存预后分析

2.4 ARNTL2 表达量及临床特征与肺腺癌患者预后的单因素分析

单因素分析结果显示，Stage 分期和ARNTL2 表达是影响肺腺癌患者总生存期的相关因素（P＜0.05）（表2）。

表2 ARNTL2 表达量及临床特征与肺腺癌患者预后的单因素分析

2.5 ARNTL2 表达量及临床特征与肺腺癌患者预后的多因素分析

Cox 比例风险模型结果显示，Stage 分期和ARNTL2表达是肺腺癌患者总生存期的独立危险因素（P＜0.05）（表3）。

表3 ARNTL2 表达量及临床特征与肺腺癌患者预后的多因素分析

3 讨论

截至目前，TCGA 中总共收集33 种肿瘤约20 000个患者样本数据，包括了基因组，转录组，表观遗传等各个组学数据[11-12]。基于TCGA 数据库的各类癌症相关高质量研究论文已有近3000 篇[13]。TCGA 是使用大规模测序为主的基因组分析技术，通过与其他单位广泛的合作，分析癌症的形成机制，从而提高人们对癌症发病分子机制的科学认识，以及提高临床医生诊断、治疗和预防癌症的能力[14-15]。

肺癌是全球范围内癌症死亡的主要原因，严重危害人类健康。其中肺腺癌是目前最常见的肺癌组织学类型，所以寻找早期诊断和预后指标对肺癌的治疗具有重要的意义。有研究[4]表明，时钟基因与肿瘤的发生与发展密切相关，可以直接或间接参与改变细胞增殖，细胞凋亡和肿瘤免疫等过程。ARNTL2 在多种肿瘤中呈高表达，与结肠癌的生长、浸润、转移等生物学特征密切相关[7]。Polo 等[9]发现ARNTL2 表达增加与肝癌的高风险临床病理因素之间的关联。Wendeu-Foyet等[10]发现ARNTL2 表达增加和乳腺癌发生发展有关。Wang 等[16]在ARNTL2 在胰腺导管腺癌PDAC 组织和细胞系中高表达，与患者预后不良呈正相关。体外实验[6-7，16]表明ARNTL2 促进PDAC 细胞增殖和侵袭能力。最新生物信息学研究发现ARNTL2 在结直肠癌组织高表达，与预后相关[17]。体外研究[18-20]发现ARNTL2通过激活PI3K/AKT/mTOR 信号通路，进一步调控上皮间质转化的活性，从而促进结肠癌细胞的增殖和迁移。目前，关于ARNTL2 在肺腺癌中的表达模式及其作用还未明确[21]。本研究结果显示，ARNTL2 在肺腺癌组中的表达高于癌旁对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；单因素分析结果显示，肺腺癌患者的年龄、Stage 分期和N 分期是影响ARNTL2 表达的相关因素（P＜0.05）；生存预后分析结果显示，ARNTL2 表达与肺腺癌患者总生存期存在相关性（P＜0.05）；单因素分析结果显示，Stage 分期和ARNTL2 表达是影响肺腺癌患者总生存期的相关因素（P＜0.05）；Cox 比例风险模型结果显示，Stage 分期和ARNTL2 表达是肺腺癌患者总生存期的独立危险因素（P＜0.05）。上述结果提示ARNTL2 可能是肺腺癌的潜在生物标志物，在肿瘤发生发展过程中发挥了重要作用。

综上所述，通过分析TCGA 数据库中肺腺癌的数据，可知ARNTL2 在肺腺癌中高表达且与临床特征具有相关性，可以推测ARNTL2 在肺腺癌的发生发展中发挥了重要作用，进一步影响肺腺癌患者的预后。因此，ARNTL2 可作为肺腺癌潜在预后标志物或治疗靶点，接下来可以进一步收集临床样本进行验证，为研究肺腺癌发生发展的分子机制提供参考。