电针对骶髓损伤后神经源性膀胱尿潴留大鼠尿动力学的影响和机制研究

胡映秋 王开阳 扶流祥 吴利东 徐美玲

1.南昌大学第二附属医院急诊科，江西南昌 330000；2.南昌大学第二附属医院泌尿外科，江西南昌 330000

骶髓损伤后神经源性膀胱指的是骶段脊髓病变、腰椎病变引起脊髓损伤导致损伤骶髓初级排尿中枢，或者是由于临近体神经与副交感神经病变导致的膀胱功能障碍，具体表现包括逼尿肌无反射，膀胱容量逐渐扩大，尿液无法正常排出[1]。这一膀胱功能障碍使膀胱组织细胞形态学出现病理层面的改变，可能继发尿路反复性感染，严重情况下还可能出现肾衰，被认为是脊髓损伤病死的主要原因[2]。因此针对骶髓损伤后神经源性膀胱尿潴留，需要重视改善其尿动力学状况，提高膀胱功能。中医将尿潴留纳入“癃闭”范畴，针灸作为中医传统疗法，被证实可对膀胱功能形成双相调节，还能有效抗泌尿系感染[3]。一项动物实验研究发现，对该病模型大鼠给予电针治疗能增强其逼尿肌兴奋程度，提高膀胱收缩张力，帮助膀胱排尿功能得以重建[4]。本研究选择30 只雄性SD 大鼠，分为三组后分析电针治疗的应用价值。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

10%水合氯醛，手术台，微型蚊式钳，眼科剪，庆大霉素（宜昌人福药业有限责任公司，国药准字H42022058），电针治疗仪（安阳市翔宇医疗设备有限责任公司，XYD-Ⅲ型，产品标准编号：YZB/豫0050-2009），F3 导管，微量灌注泵，多通道生理记录仪[ADInstruments POWERLAB，药（械）准 字：20153212513]，Primer-BLAST，TRIzol 试剂（上海恪敏生物科技有限公司），反转录试剂盒[金克隆（北京）生物技术有限公司，规格：50T RE0510]，据蛋白质定量试剂盒（BCA）[北京库尔科技有限公司，批准文号：京药监械（准）字2011 第2400737 号]，5%脱脂奶粉 （石家庄君乐宝乳业有限公司），Western 洗涤缓冲液（TBST）（上海联迈生物工程有限公司，货号：LM-2925）。

1.2 实验动物及分组

材料：选择30 只健康成年雄性SD 大鼠作为本研究材料，大鼠均为无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级别，体重250～300 g，均采购于本地区实验动物中心，有正规实验动物使用许可证，许可证号：SYXK（赣）2020-0016。本研究整个动物实验过程均与动物伦理委员会标准相符合。

分组：按照随机数字表法选择其中10 只作为对照组，另外20 只建立骶髓损伤后神经源性膀胱尿潴留模型，建模成功后再将这20 只大鼠随机分为模型组（10 只）和电针组（10 只）。

1.3 方法

1.3.1 建模 根据脊髓横断法进行模型制备，具体操作如下。选择10%水合氯醛行腹腔注射进行麻醉处理，将大鼠放置为俯卧位固定在手术台。骨性标志选定为连接第13 浮肋的T13，向上以此类推，完成T10的定位，并进行备皮处理，碘伏消毒后于后正中线从T8 到T12作纵向切口。将皮肤切开并逐层进行钝性分离处理，将T9到T11共3 个棘突以及横突暴露出来。将横突通过镊子夹住并固定，选择微型蚊式钳T10椎板咬除，将2 mm 直径的脊髓暴露出来，迅速通过眼科剪将脊髓剪断，之后迅速能观察到大鼠两下肢有抽搐反应，尾巴会甩动，接着会彻底松弛。止血后将各层按顺序关闭，选择庆大霉素涂抹伤口。

1.3.2 建模成功标准 建模24 h 之后能触及膀胱隆起，且脊髓损伤的行为学评分（Basso-Beattie-Bresnahan，BBB）评分[5]结果为0 分，前肢可行走，后肢处于拖动状态。本研究20 只大鼠均成功建模。建模后大鼠均保持单笼饲养，饲养温度恒定37℃，予其自由饮水、进食，每天按压其膀胱帮助其排尿以及排便，频率2～3 次/d，另外每天选择20 万U 青霉素进行腹腔注射进行伤口感染预防，持续使用1 周。

1.3.3 治疗 对照组不给予治疗，模型组不给予治疗，电针组以次髎、三阴交以及中极为穴位进行针刺治疗，穴位定位：次髎穴处于第2 骶后孔部位直刺15 mm 左右，中极穴处于神阙穴与耻骨联合上缘连线的上4/5 与下1/5 的交点平刺5 mm，三阴交穴位处于后肢内踝尖直上方1 cm 部位直刺5 mm。电针刺激通过电针治疗仪进行，疏密波分别设置为10、50 Hz，相应工作5、9 s，以大鼠肢体轻微颤动为宜。针刺双侧次髎穴位时左侧与正极连接，右侧与负极连接，针刺中极穴位时与负极连接，针刺三阴交穴位时与正极保持连接，并且进行三阴交针刺时应该保持左右侧交替取穴。每天治疗1 次，每次治疗时间持续20 min，持续治疗1 周。

1.4 观察指标

采集及处理标本：所有大鼠均在结束尿动力学检查后，通过水合氯醛实施腹腔麻醉，中心点选定为L2～L3椎间隙，取其上、下分别1 cm 左右位置的脊髓组织，通过生理盐水将取下的脊髓组织清洗干净，置于-80℃温度下保存待用。

尿动力学评价：所有大鼠完成麻醉处理后，将膀胱排空，将F3 导管置入尿道，连接微量灌注泵、多通道生理记录仪，保持0.1 ml/min 的恒定速度灌注恒温生理盐水，将各组大鼠膀胱最大容量、膀胱基础压、漏尿点压力、膀胱顺应性记录下来。

PCR 试验：根据基因库（GenBank）中大鼠热休克蛋白20（heat shock proteins-20，HSP-20）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、B 淋巴细胞瘤-2 基因（Bcell lymphoma-2，Bcl-2）、BCL2-Associated X 蛋白质（BCL2-Associated X protein，Bax）、半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、磷酸酶及张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）、叉头框蛋白O1 （forkhead box protein O1，FOXO1）、β-actin 的mRNA 序列，通过Primer-BLAST 完成PCR 引物的设计。依据试剂说明书通过TRIzol 试剂相应提取三组大鼠脊髓组织的总RNA，通过反转录试剂盒反转录将RNA 为互补cDNA，继续依据说明书通过SYBR Green Ⅰ染料法完成定量PCR 试验。PCR 反应程序：95℃下进行0.5 min 预变性；94℃变性5 s，60℃退火0.5 min，72℃延伸0.5 min（上述3 个温度扩增40个循环）；最后72℃下进行10 min 延伸。实验共进行3次，以3 次平均值记录为最终结果。

Western blot 试验：称量50 mg 脊髓组织样品，匀浆处理，留心处理后留取上层清液，根据BCA 法说明书测定蛋白浓度，5×Loading buffer 混合均匀，行持续5 min 的沸水浴。每泳道上样蛋白40 μg，聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶、湿法转膜，接着浸泡在5%脱脂奶粉中，室温环境下静置1 h 左右。之后把膜、一抗放在4℃冰箱中进行过夜孵育，1×TBST 进行3 次清洗，每次清洗持续10 min。接着选择1×TBST 稀释的二抗放在37℃环境下进行1 h 孵育，继续用1×TBST 进行3次清洗，每次清洗持续15 min。显色曝光后扫描底片，对蛋白灰度进行统计分析。

1.5 统计学方法

利用SPSS 23.0 分析所有数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，三组比较采用ANOVA 分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组尿动力学的比较

三组的膀胱顺应性、漏尿点压力、膀胱基础压、膀胱最大容量结果比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、电针组的上述指标均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；电针组上述指标结果均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 三组大鼠尿动力学的比较（±s）

表1 三组大鼠尿动力学的比较（±s）

与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；1 cmH2O=0.098 kPa

对照组模型组电针组F 值P 值10 10 10 0.09±0.01 0.19±0.02a 0.13±0.01ab 5.462 0.000 38.89±2.21 52.16±4.17a 44.18±3.19ab 6.819 0.000 26.03±2.19 29.73±2.38a 27.15±2.47ab 5.378 0.000 1.18±0.13 4.40±0.36a 2.30±0.21ab 8.814 0.000组别 例数 膀胱顺应性（ml/cmH2O）漏尿点压力（cmH2O）膀胱基础压（cmH2O）膀胱最大容量（ml）

2.2 三组大鼠HSP20、PTEN 的mRNA 表达的比较

三组HSP20、PTEN 的mRNA 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、电针组大鼠脊髓组织HSP20 的mRNA 水平均低于对照组，PTEN 的mRNA水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；电针组大鼠脊髓组织HSP20 的mRNA 水平高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），电针组大鼠脊髓组织PTEN 的mRNA 水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 三组大鼠脊髓组织HSP20、PTEN 的mRNA 水平的比较（±s）

表2 三组大鼠脊髓组织HSP20、PTEN 的mRNA 水平的比较（±s）

与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

对照组模型组电针组F 值P 值10 10 10 1.70±0.39 0.68±0.16a 1.22±0.30ab 7.182 0.000 0.86±0.21 2.33±0.56a 1.50±0.35ab 11.057 0.000组别 例数 HSP20 mRNA PTEN mRNA

2.3 三组大鼠Akt 活化及凋亡通路mRNA 表达的比较

三组Bax、FOXO1、Bcl-2、Caspase-9、Akt 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、电针组Bcl-2、Akt 水平均低于对照组，Bax、FOXO1、Caspase-9 均高于对照组，差异有统计学意义 （P＜0.05）；电针组Bax、FOXO1、Caspase-9 水平均低于模型组，Bcl-2 高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），电针组、模型组Akt 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表3 三组大鼠脊髓组织Akt 通路凋亡相关因子mRNA 水平（±s）

表3 三组大鼠脊髓组织Akt 通路凋亡相关因子mRNA 水平（±s）

与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

对照组模型组电针组F 值P 值10 10 10 0.28±0.06 1.31±0.33a 0.94±0.22ab 7.593 0.000 0.92±0.21 2.56±0.63a 1.48±0.37ab 6.832 0.000 1.51±0.33 0.62±0.15a 1.12±0.27ab 7.924 0.000 0.85±0.21 1.67±0.41a 1.19±0.29ab 10.057 0.000 1.06±0.13 1.01±0.11a 1.00±0.10a 3.054 0.019组别 例数 Bax FOXO1 Bcl-2 Caspase-9 Akt

3 讨论

中医将尿潴留纳入“癃闭”范畴，认为其发生是由于肾气不足，膀胱气化失司，三焦无法通调水道而起[6]。本研究电针组治疗选择的穴位为次髎、中极以及三阴交穴，其中次髎为膀胱经穴位，不仅为局部取穴，也是膀胱病变治疗的常用穴位。中医典籍中有“次髎，主大小便不利”；三阴交穴是足三阴经交会穴，足三阴经循行少腹或阴器，有通调下焦气机的作用，可对膀胱功能起到调节作用[7]。中极穴是膀胱募穴，属于足三阴与任脉之会，中医中六腑病变取穴治疗多取此处穴位，中极穴被认为是膀胱病变治疗的重要穴位[8]。

从排尿反射神经通路这一层面来看，排尿中枢处在骶丛神经，次髎穴下有支配盆腔脏器的骶神经，对这一穴位进行针刺治疗能将与排尿相关的传入与传出神经激活，还能经传入神经元向高级中枢传导刺激，激发逼尿肌、膀胱内括约肌节律性收舒运动，最终建立并完成排尿反射[9]。三阴交穴位下通过着L4~S3神经根的胫神经，且深层有L5、S1神经节段，浅层有属于L4神经节段的隐神经，通过对这一穴位进行刺激治疗能经反射弧传至脊髓后根，对腰骶部排尿中枢有激发作用，可促进反射性排尿[10]。研究对三阴交、次髎等穴位进行针刺治疗，显示患者尿道括约肌舒缩功能、膀胱运动功能均有明显改善，同时膀胱最大容量明显下降，残余尿量明显减少[11-12]。中极穴处在膀胱局部，是支配膀胱、直肠的神经分支-髂腹下神经，对这一穴位进行针刺治疗能对膀胱产生刺激，促使膀胱逼尿肌收缩，帮助膀胱皱襞能再次皱缩，促进排尿反射，生成尿意[13]。研究对关元与中极穴进行电针治疗，显示电针可经自主神经刺激传入神经，对膀胱活动形成调节，并能帮助恢复膀胱功能[14-15]。

本研究电针组治疗后膀胱最大容量、漏尿点压力、膀胱顺应性均较模型组明显下降，接近对照组水平，提示电针治疗能改善脊髓损伤尿潴留患者的排尿中枢功能，促使膀胱逼尿肌弹性提升，能帮助逼尿肌反射逐渐恢复，并维持正常收缩功能，减低膀胱最大容量，减少残余尿量，进而使膀胱功能得到改善。本研究电针组大鼠脊髓组织HSP20 的mRNA 水平高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），电针组大鼠脊髓组织PTEN 的mRNA 水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），证实HSP20 上升、PTEN 下降能提高Akt 活性，表明电针治疗对脊髓损伤尿潴留的作用机制可能与HSP20、PTEN 水平具有紧密联系。另外本研究显示模型组、电针组Bcl-2、Akt 水平均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组、电针组Bax、FOXO1、Caspase-9 均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；电针组Bax、FOXO1、Caspase-9 水平均低于模型组，Bcl-2 高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），电针组、模型组Akt 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示接受电针治疗能提升Akt 活性，并会对下游Bcl-2、Bax、Caspase-9、FOXO1 的表达产生影响，对细胞凋亡发挥抑制作用。上述结果表明，骶髓损伤后神经源性膀胱尿潴留会加快细胞凋亡，神经细胞受损，因此脊髓、膀胱功能会受到影响，膀胱排尿功能变得异常，最终引发尿潴留[16]。通过实施电针治疗，能加快HSP20表达，促进其磷酸化转变，对PTEN 表达产生抑制，并提升Akt 活性，提升下游Bcl-2 水平，对凋亡因子包括Bax、Caspase-9、FOXO1 的表达产生抑制，形成对细胞凋亡的抑制作用，最终帮助恢复部分脊髓神经功能，并使神经中枢对膀胱组织的调控得以提升，使逼尿肌、括约肌的功能以及膀胱内压维持在正常水平，使膀胱排尿功能、收缩功能得以改善，最终能使尿潴留症状逐渐减轻[17-18]。

综上所述，电针治疗骶髓损伤后神经源性膀胱尿潴留大鼠能改善其尿动力学，具体作用机制考虑与抑制PTEN 表达、促进HSP20 磷酸化与表达，并进一步抑制凋亡通路、提高Akt 活性相关。