CYP3A4、PXR和IL-10基因多态性对43名中国健康受试者空腹及餐后口服氨氯地平药代动力学特征的影响

刘林林 阿萨亚 刘建芳 陈 琳 刘 丹 谢宏波 刘名义 夏春华▲

1.南昌市洪都中医院临床试验机构，江西南昌 330038；2.南昌大学临床药理研究所，江西南昌 330031；3.江西省皮肤病专科医院药剂科，江西南昌 330000

氨氯地平选择性抑制钙离子跨膜进入心肌细胞或平滑肌细胞，有效降低血管收缩力，临床广泛用于治疗高血压和缺血性心脏病[1]。但氨氯地平的治疗效果常具有明显的个体差异[2]，药物代谢酶的基因多态性常常被认为是其重要影响因素之一。氨氯地平主要经细胞色素P450 3A4（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）酶进行代谢[3]，它在不同个体中的表达水平以及酶活性也都显示出明显的种族异质性和个体差异，极大地影响了治疗结果[4-5]，常常导致治疗失败，甚至严重的药物毒副作用。其本身的遗传多态性是药物代谢个体间差异的主要来源[6-8]。此外，孕烷X 受体（pregnane X receptor，PXR）的基因多态性也是导致CYP3A4 在不同人群中差异的重要因素之一[9-11]，而白介素-10（interleukin-10，IL-10）则有研究表明，在给予健康受试者IL-10 后，CYP3A4 的活性约降低12%[12]，表明CYP3A4 的基因多态性可直接影响或通过PXR 或IL-10 基因多态性改变CYP3A 酶系的活性，从而间接影响氨氯地平的药代动力学过程。本研究旨在探讨CYP3A4、PXR 和IL-10 基因多态性对43 名中国健康受试者空腹及餐后单次口服氨氯地平药代动力学特征的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本临床研究完成于2015年，并获得医学伦理委员会的批准{[2014]伦理审第（050）号}，所有受试者均在筛选前签署知情同意书，共有43 名中国籍健康男性受试者入组此项研究，年龄18～40 岁，平均（23.1±1.6）岁；体重指数（body mass index，BMI）19～24 kg/m2，平均（21.4±1.7）kg/m2，所有受试者试验前经一般体格检查、询问既往用药史、实验室检查（检查项目包括血常规、尿常规、肝肾功能等）以及心电图检查，未发现异常，身体状况良好，均无烟酒嗜好，在试验前2 周内未服用过任何其他药物。

1.2 方法

受试者按随机数字表法分为空腹组和餐后组，分别在空腹状态和高脂高热量饮食后30 min 单剂量交叉口服给予10 mg 苯磺酸氨氯地平片（北京天然药物研究所平衡南洋制药厂；生产批号：19-131104；规格：10 mg/片），分别于给药前和给药后2、4、5、6、7、8、10、12、24、48、72、96、120、144、168 h 共16 个时间点采集4.0 ml 上肢静脉血，分离取上层血浆样品放置于-80℃冰箱冷冻避光保存，两试验周期之间设两周的清洗期。血样中氨氯地平的浓度通过液相二级质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LCMS/MS）方法进行测定。

1.3 基因分型

使用DNA 纯化试剂盒（北京全式金）提取外周血基因组DNA，然后采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法对CYP3A4（13989A>G、15820C>G、17776Ainsertion）、PXR（24381A>C、3'UTR10719G>A、3'UTR11193T>C）和IL-10（1082G>A、819C>T、592C>A）进行基因分型。PCR 反应体系共25 μl，包含2×Easy Taq＠PCR SuperMix 12.5 μl，正向引物（10 μmol/L）0.5 μl，反向引物（10 μmol/L）0.5 μl，ddH2O 6.5 μl，基因组DNA 5 μl。PCR 反应程序设置如下：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30 个循环，72℃延伸7 min，扩增后的产物37℃消化2 h，PCR 最终产物用2%的琼脂糖凝胶电泳条带分析。

1.4 血浆中氨氯地平的检测

1.4.1 色谱条件 色谱柱：Lunna-C18柱（50 mm×2.0 mm，5 μm）；流动相：2 mmol/L 甲酸铵（PH3.0）:乙腈=65∶35（v/v）；流速：400 L/min。

1.4.2 质谱条件 离子化方式：电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI+）；监测方式：多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；雾化器压力（Gas1）：40 psi；离子化电压：5500 V；检测离子：m/z 409.1→238.0（氨氯地平）以及m/z 480.2→315.0（内标物尼卡地平）。

1.4.3 血浆样品处理方法 有机溶剂液液萃取法。取200 μl 待测血浆，精密加入20 μl 内标（1.0 ng/ml）和20 μl 空白溶剂，再加入20 μl 氢氧化钠溶液（1 mol/L），以及1000 μl 叔丁基甲醚，涡旋振荡3 min，15 000 r/min离心5 min，离心半径8.2 cm，分层，取上层清液850 μl置于浓缩挥干仪中45℃减压干燥约20 min，残渣用200 μl 流动相进行复溶，涡旋振荡3 min，20 000 r/min离心5 min，离心半径8.2 cm，取上层清液100 μl 进行分析测定。血浆中的氨氯地平在0.05～16.2 ng/ml 范围内线性关系良好，检测方法无明显的基质效应，低、中、高浓度的提取回收率＞85%，批间、批内精密度与准确度均符合要求[13]。

1.5 药物代谢动力学分析

本研究中血药浓度数据用DAS 2.1 软件以非房室模型对氨氯地平在体内的药动学参数进行估算分析，药动学参数主要包括峰浓度（cmax），达峰时间（Tmax），半衰期（t1/2）和药时曲线下面积（area under the curve，AUC）。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0 进行χ2检验判定各基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律，计量数据采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组间比较采用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 受试者的一般资料

空腹组最终完成试验的男性健康受试者22 名，年龄21～24 岁，平均（22.0±0.8）岁；身高162～178 cm，平均（169.9±4.4）cm；体重52.0～75.0 kg，平均（61.8±6.9）kg；体重指数19.0～23.9 kg/m2，平均（21.4±1.8）kg/m2。餐后组入组健康男性受试者22 名，最终完成试验者有21 名，年龄22～28 岁，平均（24.0±1.5）岁；身高168～180 cm，平均（171.6±4.1）cm；体重51.1～74.3 kg，平均（63.0±5.8）kg；体重指数19.2～24.0 kg/m2，平均（21.4±1.7）kg/m2。两组受试者的年龄、身高、体重和BMI 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.2 43 名受试者的CYP3A4、PXR 和IL-10 各突变位点基因分型结果

本研究通过PCR 方法对CYP3A4、PXR 和IL-10进行基因分型，结果显示CYP3A4 在17776 A insertion、15820C>G、13989A>G 位点的突变频率分别为11.6%（5/43）、20.9%（9/43）、16.5%（7/43），PXR 在24381A>C、3'UTR11193T>C、3'UTR10719G>A 位点的突变频率分别为27.9%（12/43）、25.5%（11/43）、18.6%（8/43），IL-10 在592C>A、819C>T、1082G>A 位点的突变频率分别为18.6%（8/43）、23.2%（10/43）、11.6%（5/43）。对上述基因型进行Hardy-Weinberg 遗传平衡检验，结果均显示P＞0.05，基因型符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律，具有群体代表性。

2.3 43 名受试者CYP3A4、PXR 和IL-10 各突变位点间的关联性分析

通过对CYP3A4、PXR、IL-10 三个基因突变的相互影响的关联性分析，结果显示IL-10 突变与PXR突变呈明显相关性，其他基因之间关联性不大（表1），IL-10 突变引起PXR 突变的概率为71.4%，不引起PXR 突变的概率为28.6%。

表1 43 名受试者CYP3A4、PXR 和IL-10 各突变位点间的关联性分析[n（%）]

2.4 两组药物代谢动力学参数的比较

CYP3A4、PXR 和IL-10 各基因突变位点对空腹及餐后口服氨氯地平的受试者体内主要药动学参数（AUC0-∞、AUC0-t、t1/2或cmax）均无显著影响（P＞0.05）（表2）。空腹组和餐后组的氨氯地平药动学参数差异结果显示，餐后组的cmax、AUC0-t和AUC0-∞高于空腹组，差异有统计学意义（表3）。

表2 CYP3A4、PXR 和IL-10 各基因突变位点对口服氨氯地平的43名受试者体内主要药动学参数（AUC0-∞、AUC0-t、t1/2 或cmax）影响的方差分析结果

表3 空腹组和餐后组口服给予10 mg 氨氯地平后药代动力学参数的比较（s）

表3 空腹组和餐后组口服给予10 mg 氨氯地平后药代动力学参数的比较（s）

与空腹组比较，aP＜0.05

空腹组餐后组43.40±9.32 42.75±7.57 4.18±0.73 5.17±1.83a 6.18±1.84 7.71±4.36 212.09±40.53 291.20±92.02a 228.57±52.37 313.21±103.47a组别 t1/2（h）cmax（ng/ml）Tmax（h）AUC0-t（ng·h/ml）AUC0-∞（ng·h/ml）

3 讨论

氨氯地平是临床上常用的降压药之一，在体内主要经肝脏CYP3A4 酶系代谢，其疗效在个体间存在显著差异，可能与药物代谢酶CYP3A4 的基因多态性有关。储小曼等[14]发现CYP3A4*4、*5、*6 等位基因的存在可能降低药物代谢酶CYP3A4 的活性，从而影响环孢素A 在体内的代谢过程，CYP3A4*4、*5、*6 分别对应13989A>G、15820C>G、17776 A insertion 三个突变位点。CYP3A4 受多种转录因子的调控，其中PXR 被认为是最关键的转录因子，其基因多态性可能间接影响CYP3A4 的表达水平[11，15]。虽然在PXR 中发现了许多单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNPs），并且似乎影响PXR 功能，但是其对人类受试者中CYP3A4 表达的影响还未深入研究[10]。另一方面，IL-10 是一类抗炎细胞因子，影响基因转录和蛋白质合成，也能参与调节CYP3A4 的酶活性[16]。研究发现，IL-10 存在的3 个SNPs，即1082G>A、819C>T和592C>A 可能与IL-10 表达降低相关[17]。因此，本研究探讨CYP3A4-（Exon-917776A）、CYP3A4-（Exon7-15820C>G）、CYP3A4-（Exon5-13989A>G）；PXR-（Exon1-24381A>C）、PXR-（3'-UTR11193T>C）、PXR-（3'-UTR10719G>A）；IL-10-（592C>A），IL-10-（819C>T），IL-10-（1082G>A）9 个突变位点对氨氯地平药代动力学特征的影响。

本研究结果显示，三个CYP3A4 基因型、三个PXR 基因型和三个IL-10 基因型对氨氯地平在体内的药动学参数无明显影响（P＞0.05）。Guo 等[18]研究基因多态性因素对高血压患者氨氯地平药代动力学过程的影响时发现CYP3A4*1G 和CYP3A5*3 的基因多态性对氨氯地平血药浓度无影响（P>0.05），与本研究在健康受试者中所获得的结果相一致。在CYP3A4 所发现的39 个突变位点中，绝大多数位点的突变不会改变酶的活性，仅有少数位点上的突变能影响酶的活性[1]。本研究中未能观察到CYP3A4、IL-10 和PXR 的基因突变体对氨氯地平药代动力学过程有明显的作用，可能存在以下几方面的原因：首先，本研究中选取突变位点对氨氯地平的药代动力学影响轻微，PXR 或IL-10 上可能存在着其他调控作用比较明显的SNPs；其次，药物代谢过程受到一些其他因素如年龄、身体生理状况等的影响；最后，除了基因方面的影响，PXR对内源性、外源性物质的接触也会影响CYP3A4 的表达。因此，需要进一步探讨更多的影响因子，为临床指导CYP3A4 代谢底物合理应用提供可靠的理论基础。

另外，本研究对43 名受试者的CYP3A4、PXR 和IL-10 各突变位点相关性进行比较分析，结果显示，IL-10 和PXR 突变频率呈明显相关性，IL-10 的突变显著增加PXR 突变的频率，提示IL-10 可能通过作用于PXR 来调控CYP3A4 的表达。但是PXR 和CYP3A4 之间的突变无明显的相关性，可能是因为所选取PXR 和CYP3A4 的突变位点之间仅仅是弱相关，或者是本研究受试者数量不足导致的。

本研究还探讨饮食因素对氨氯地平体内药代动力学的影响，结果显示，餐后组的cmax、AUC0-t和AUC0-∞高于空腹组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示高脂高热量饮食可明显增加口服途径给予的氨氯地平的体内血药浓度及其暴露量。一般来说，食物容积、温度以及食物中所含营养成分及其热量均有可能改变胃肠道的内环境，从而改变药物在胃肠道停留的时间以及药物在胃肠道液中的溶解度和渗透性，而高脂高热量食物更能影响胃肠道的理化功能，从而更能改变药物或制剂的生物利用度。饮食对氨氯地平血药浓度的影响可能产生一些严重的后果，需要在临床实践使用过程中加以关注。

综上所述，CYP3A4（17776 A insertion、15820C>G、13989A>G）、PXR（24381A>C、3'UTR11193T>C、3'UTR10719G>A）和IL-10（592C>A、819C>T、1082G>A）共9 个位点的突变体对43 名中国健康受试者体内氨氯地平的药代动力学过程无显著影响，但饮食因素可能会明显提高氨氯地平在人体内的吸收。