林芝地区猪源大肠杆菌分离与鉴定

2021-11-26桑杰罗布

魅力中国 2021年36期

桑杰罗布

（西藏那曲市职业技术学校，西藏那曲 852000）

前言

大肠杆菌病是由病原大肠杆菌引起的细菌性人畜共患病。多种类型疾病的总称，病原性大肠杆菌一般以O 抗原进行。猪大肠杆菌病是目前西藏猪生产的主要疾病之一，它流行范围大，发病率高，致死率强，临床上以高热、呼气困难、排水样或血色粪便、间进性消瘦和死亡特征，以及性出血性肠炎典型病理变化，大肠杆菌病是猪的重要传染病，给猪接种大肠肝菌病苗，预防该病就显得十分重要。病理变化一般为解剖检自然病死猪，可见舌头突出、皮下血管充血、淤血。主要病变急性出血肠炎，小肠浆膜毛细血管淤血、出血，肠管内充充满血性粘液。小肠粘膜水肿，腹腔积液，肠与瘤胃黏连在一起。肠系膜淋巴结肿胀，外观和切面成黑色。肝小叶出血，肝脏肿大呈土黄色。胆囊严重肿大，胆囊壁增厚，胆汁浑浊呈黄褐色。脾脏血管淤血，色泽变黑。肾肿大表面出血切面皮质出血、水肿；髓质淤血水肿。心壁血管淤血，会厌软骨有出血斑。气管粘膜有弥漫性的针尖大小的出血点、肺气肿、有出血和淤血斑。肺门淋巴结淤血，肿大。

本实验旨在对西藏林芝地区8 个不同样本的猪大肠杆菌的培养进行探讨，目的在于揭示了林芝地区的不同猪大肠杆菌病的特性，为该病的进一步研究提供科学依据。

一、材料与方法

（一）材料

分别采自西藏林芝地区猪源大肠杆菌的8 个不同样本进行分离与鉴定以及药敏试验。

（二）培养基

普通琼脂（普通肉汤）、营养琼脂，麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基.

（三）实验仪器

培养箱、超净工作台、-80℃冷冻箱，-20℃冷冻箱、4℃的冷藏箱、酒精棉球、培养皿、试管、三角瓶，量筒、高压灭菌锅、显微镜、酒精灯、记号笔、煮沸锅、手套

（四）试验药品

普通琼脂培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基（均购自北京陆桥生物技术有限公司）；

普通肉汤、革兰氏染色液（购自杭州天河微生物试剂有限公司）,按说明书配制。

二、方法

（一）实验方法

1.培养基的制备

按蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉浸膏10g、磷酸氢二钾2.5g、蒸馏水1000mL 的比例加入烧杯中，加热溶解，并用玻璃棒进行搅拌，煮沸后用氢氧化钠溶液调整pH 为7.4 到7.6，并继续煮沸10min,补足失去水分，滤纸过滤后分装，经121℃灭菌30min，做无菌检验和4℃贮存备用。在制备2%蛋白胨牦牛肉汤的制备。灭菌后倒琼脂平板，待凝固后，置37℃培养24h做无菌检验。

2.细菌的形态学观察

选取单个典型菌落进行纯培养，并对其进行革兰氏染色，先用接种环挑去无菌生理盐水滴一滴于载玻片上，再跳去单个菌落与生理盐水混合，待自然干燥后用火焰固定，在玻片上滴结晶紫染色液进行初染，1～2min 后水洗，加革兰氏碘液于玻片上媒染，2～3min 后水洗，再加95%酒精脱色，30s 后水洗，最后加番红复染液复染30s～1min 后水洗，自然干燥后镜检，观察细菌染色与形态。并挑取单个菌落进行纯培养，并4℃保存，备用。

三、分离与鉴定

（一）划线分离法：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线到最后，可使细菌间的距离加大。在培养10～20h 后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。其操作步骤是：将培养皿底部用拇指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1 次平行划线 3～5 条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1 次划线部分作第2 次平行划线，然后再用同样方法，通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于恒温箱培养。取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。

（二）涂布分离法：先将培养的菌液稀释，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20 个以内的单菌落最为适合。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。细菌的两种分离法各有优点都可采用。