改良麦康凯平板筛查肠道定植耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的性能评价*

康佳，赵志军，李刚，茆永娟，杨红，周云花，潘亚菲，贾伟

(1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004；2.宁夏医科大学总医院医学实验中心，银川750004；3.宁夏临床病原微生物重点实验室，银川750004)

人体肠道是致病菌的天然储存库，携带碳青霉烯酶编码基因菌株易导致耐药基因在肠道细菌之间传递[1]，使耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)肠道定植越来越普遍。研究表明，CRE定植会增加患者感染CRE的风险，造成患者死亡率升高[2]。因此，对于入院患者，尤其是重症患者进行肠道定植CRE筛查尤为重要。目前，国际上对CRE的筛查方法尚无统一标准，主要有美国疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)推荐的肉汤增菌法、商品化显色培养基、PCR方法等，但以上方法仍存在操作繁琐、检测周期长、检测成本高等问题。因此，有必要建立一种敏感性和特异性高、操作简便且适合推广使用的肠道定植CRE筛查方法。本实验通过在麦康凯培养基中分别加入3种不同碳青霉烯类药物制成改良平板，用CRE菌株和非CRE菌株检测其敏感性、特异性和最低检测限；通过临床粪便样本验证平板筛查性能，并与肉汤增菌法及CHROMagar KPC显色培养基进行对比评价。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集2019年1—12月宁夏医科大学总医院临床连续分离45株CRE菌株(包括肺炎克雷伯菌21株、大肠埃希菌12株、阴沟肠杆菌10株、产酸克雷伯菌1株和弗劳地柠檬酸杆菌1株)和30株非CRE菌株(包括肺炎克雷伯菌12株、大肠埃希菌10株、阴沟肠杆菌8株)，其中收集于2019年6—12月的20株CRE(包括肺炎克雷伯菌10株、大肠埃希菌4株、阴沟肠杆菌6株)用于最低检测限评估。同时收集2019年11—12月重症监护室患者非重复粪便样本142份。CRE判定标准：依据美国CDC发布的CRE指南[3]，亚胺培南或美罗培南最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)≥4 μg/mL和(或)厄他培南MIC≥2 μg/mL(微量肉汤稀释法)。经测序证实产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌临床分离菌为宁夏医科大学总医院医学实验中心保存，大肠埃希菌ATCC 25922购自北京百欧博伟生物技术公司。

1.2主要试剂与仪器 Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)、DL 2000 DNA marker(TaKaRa公司)；琼脂糖(西班牙BIOWEST公司)；麦康凯琼脂培养基干粉、M-H(B)培养基干粉(北京索莱宝公司)；亚胺培南药粉、美罗培南药粉、厄他培南药粉(>95%BR，大连美仑公司)；胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基、10 μg美罗培南药敏纸片(英国Oxoid公司)；CHROMagar KPC显色培养基(法国科玛嘉公司)；M-H固体培养基(郑州安图生物公司)；一次性培养皿(浙江拱东公司)；恒温培养箱(上海力申公司)；Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定系统及配套AST-GN04药敏卡、MALDI-TOF MS仪、麦氏比浊仪(法国生物梅里埃公司)；PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3PCR法检测耐药基因 煮沸法提取DNA，采用PCR法检测CRE相关耐药基因(TEM、SHV、NDM、KPC、OXA-48、VIM、IMP)，引物设计参考文献[4]。反应体系50 μL：Premix TaqTM25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，双蒸水 22 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55～57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 5 min。引物序列及退火温度见表1。引物合成及PCR产物测序均由上海生工生物工程公司完成，测序结果与GenBank中原序列进行比对鉴定。

表1 耐药基因引物序列、产物长度和退火温度

1.4改良麦康凯平板、CHROMagar KPC显色培养平板的制备及结果判读 分别称取3.3 g CHROMagar KPC显色培养基干粉及51.5 g麦康凯琼脂干粉，各溶解于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。待培养基冷却至45～50 ℃时，向CHROMagar KPC显色培养基中加入0.4 g增补剂(试剂自带)，同时依据CLSI M100第30版[5]肠杆菌科关于各药物耐药的MIC折点，向麦康凯培养基中分别加入3种碳青霉烯类药物(终浓度为亚胺培南4 μg/mL、美罗培南4 μg/mL、厄他培南2 μg/mL)。轻轻摇动锥形瓶，混匀后立即倾注25 mL至90 mm平皿中，凝固后备用。标本接种于改良麦康凯平板35 ℃培养16～18 h后菌落经Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定系统及配套AST-GN04药敏卡鉴定为肠杆菌科细菌且亚胺培南或美罗培南MIC≥4 μg/mL和(或)厄他培南MIC≥2 μg/mL则判定为CRE[3]。标本接种CHROMagar KPC显色培养基35 ℃培养16～18 h后菌落呈暗粉红色到红色菌落为碳青霉烯类耐药大肠埃希菌，菌落呈深蓝色则为碳青霉烯类耐药克雷伯菌属、肠杆菌属、枸橼酸杆菌。

1.5肉汤增菌法 根据CRE指南[3]，制备100 μL粪便悬液(每毫升生理盐水约0.5 g粪便)，将其加入含有一片10 μg美罗培南药敏纸片的5 mL TSB培养基中。置于35 ℃培养16～18 h后吸取100 μL培养液移种至普通麦康凯平板上，过夜培养。挑取乳糖发酵的菌落用Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪及配套AST-GN04药敏卡进行菌株鉴定和药物敏感性试验。

1.6微量肉汤稀释法 根据药物的理化性质及使用说明将亚胺培南和美罗培南分别配制成终浓度为2 560 μg/mL的药物储存液，在96孔板中连续倍比稀释后得到一系列100 μL药物梯度稀释液(药物浓度范围为0.125～256 μg/mL)。将待测菌经M-H琼脂平板35 ℃过夜培养后配制成0.5麦氏浊度的菌悬液，稀释100倍后取100 μL菌悬液分别接种于含100 μL药物的小孔中。阴性对照孔加入200 μL菌悬液，空白对照孔加入200 μL M-H肉汤培养基。将接种好的96孔板置于35 ℃恒温培养箱24 h后观察细菌，将菌体生长量约80%被抑制判为终点孔。质控菌株：大肠埃希菌ATCC 25922，结果解释参照CLSI文件[5]。

1.7敏感性与特异性检测 菌株经血平板复苏后，分别接种于3种不同抗菌药物的改良麦康凯平板，置于35 ℃培养16～18 h，观察是否长出菌落。经测序证实产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌为阳性质控，大肠埃希菌ATCC 25922为阴性质控。

1.8最低检测限的评估 选取20株CRE临床菌株经接种血平板复苏后，用生理盐水配置成0.5麦氏浊度单位菌悬液，并进行101～106倍比稀释，制成102～108CFU/mL菌悬液，取不同浓度的菌悬液10 μL分别接种于3种不同抗菌药物的改良麦康凯平板，置35 ℃培养16～18 h，观察是否长出菌落，所有菌株重复检测3次。

1.9临床样本的性能验证 将142份粪便样本分别用肉汤增菌法、CHROMagar KPC显色培养基以及改良麦康凯平板3种方法接种，置于35 ℃培养16～18 h，观察是否生长菌落。将长出的菌落分离纯化后用Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪进行菌株鉴定和药物敏感性试验，并用MALDI-TOF MS及微量肉汤稀释法复核最终结果。药敏试验操作方法及结果解释参照CLSI标准[5]。

1.10统计学分析 用SPSS 26.0软件进行。计数资料用例数表示，方法间筛查结果的一致性采用Kappa一致性检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1PCR结果 45株CRE中仅检出1种耐药基因15株，检出2种耐药基因25株，另外5株检出3种耐药基因。TEM、SHV检出率分别为62.22%(28/45)和24.44%(11/45)，NDM、KPC、OXA-48的检出率分别为62.22%(28/45)、15.56%(7/45)和13.33%(6/45)，未检出IMP及VIM。见表2。

表2 45株CRE的耐药基因结果

2.2改良麦康凯平板检测CRE的敏感性及特异性 45株CRE中，亚胺培南改良麦康凯平板上有1株携带blaTEM大肠埃希菌未生长；美罗培南改良麦康凯平板上有2株未生长，分别为携带blaTEM大肠埃希菌和blaKPC肺炎克雷伯菌；45株CRE均在厄他培南改良麦康凯平板上生长。30株非CRE菌株，除2株肺炎克雷伯菌在厄他培南改良麦康凯平板上生长外，其余菌株均不生长。亚胺培南、美罗培南、厄他培南改良麦康凯平板分别检出44株、43株和45株CRE，敏感性分别为97.78%(44/45)、95.56%(43/45)和100%(45/45)；亚胺培南与美罗培南改良平板特异性均为100%(30/30)，厄他培南为93.33%(28/30)；美罗培南与亚胺培南改良平板阳性预测值一致，为100%，厄他培南为95.74%；阴性预测值由高到低分别为厄他培南改良平板(100%)、亚胺培南改良平板(96.77%)和美罗培南改良平板(93.75%)。

2.3改良麦康凯平板最低检测限评估 20株CRE中，接种菌液浓度为108CFU/mL时，亚胺培南、美罗培南、厄他培南改良平板上分别有14株、13株、20株生长，检出率分别为70%(14/20)、65%(13/20)和100%(20/20)；接种菌液浓度为107CFU/mL时，亚胺培南、美罗培南、厄他培南改良平板上分别有11株、10株、20株生长，检出率分别为55%(11/20)、50%(10/20)和100%(20/20)；接种菌液浓度为106CFU/mL时，亚胺培南、美罗培南、厄他培南改良平板上分别有8株、7株、20株生长，检出率分别为40%(8/20)、35%(7/20)和100%(20/20)；接种菌液浓度为105CFU/mL时，亚胺培南、美罗培南、厄他培南改良平板上分别有3株、5株、19株生长，检出率分别为15%(3/20)、25%(5/20)和95%(19/20)；接种菌液浓度为104CFU/mL时，亚胺培南、美罗培南、厄他培南改良平板上分别有2株、2株、19株生长，检出率分别为10%(2/20)、10%(2/20)和95%(19/20)。见表3。

表3 3种改良麦康凯平板最低检测限评估

2.43种方法从粪便中筛查CRE能力的比较 经确认，142份粪便样本中，共有5株CRE，包括4株大肠埃希菌及1株肺炎克雷伯菌。肉汤增菌法共检测出7株菌，其中包括5株CRE(大肠埃希菌4株，肺炎克雷伯菌1株)及2株非CRE(碳青霉烯类敏感的大肠埃希菌和恶臭假单胞菌各1株)；CHROMagar KPC显色培养基检测出5株CRE(大肠埃希菌4株，肺炎克雷伯菌1株)和1株恶臭假单胞菌；亚胺培南、美罗培南、厄他培南改良麦康凯培养分别检出3株CRE(大肠埃希菌)、2株CRE(大肠埃希菌)、4株CRE(大肠埃希菌3株，肺炎克雷伯菌1株)，均未检出非CRE菌株。

肉汤增菌法与CHROMagar KPC显色培养基筛查结果差异无统计学意义(P>0.05，Kappa=0.919)；3种改良麦康凯平板与肉汤增菌法筛查结果均一致，差异无统计学意义(P>0.05)，厄他培南改良麦康凯平板与其一致性(Kappa=0.717)高于亚胺培南(Kappa=0.588)与美罗培南(Kappa=0.563)；3种改良麦康凯平板与CHROMagar KPC显色培养基筛查结果均一致，差异无统计学意义(P>0.05)，厄他培南改良麦康凯平板与其一致性(Kappa=0.885)大于亚胺培南(Kappa=0.657)及美罗培南(Kappa=0.489)。

3 讨论

本研究建立一种基于改良麦康凯平板的快速筛查CRE的方法，同时利用临床菌株及粪便样本评价其检测性能。结果显示，亚胺培南、美罗培南和厄他培南改良平板特异性分别为100%、100%和93.33%，敏感性分别为97.78%、95.56%和100%。本实验中发现4株仅检测出blaTEM的大肠埃希菌中有1株未在亚胺培南改良麦康凯平板上生长，其他3株却可以生长。目前已报道的CRE相关耐药基因有很多种[6]，而本研究只检测了其中7种，该菌株是否携带其他耐药基因或由其他耐药机制造成还未可知。有文献报道，碳青霉烯酶浓度[7]、亚型及相关β-内酰胺酶基因的表达差异[8]均会影响药物抑菌效果，这可能会导致携带不同耐药基因的同种菌株在3种药物改良平板上生长状况不同。用20株CRE评估3种不同药物改良平板最低检测限时发现：不同菌株或不同基因型的相同菌株在同种药物改良平板上生长的最低检测限略有差异，亚胺培南、美罗培南改良麦康凯平板最低检测限大多分布在105～108CFU/mL接种水平，而厄他培南改良麦康凯平板最低检测限集中分布于102～103CFU/mL。可见，厄他培南改良平板最低检测限优于亚胺培南及美罗培南改良平板。陈善建等[9]以KPC型CRE为主评估亚胺培南、美罗培南、厄他培南改良法国科玛嘉尿路显色培养基最低检测限，也发现厄他培南平板具有更低的检测限。Ramachandran等[10]从药物结构及分子动力学的角度阐释了这3种碳青霉烯类药物抑菌效果存在差异的原因，并表明相较于厄他培南，美罗培南和亚胺培南治疗细菌感染效果更好，这也为本实验中厄他培南改良平板上菌株更易生长提供了理论依据。

本研究中的3种碳青霉烯类药物改良麦康凯平板与肉汤增菌法及CHROMagar KPC培养基在筛查肠道定植CRE方面均具有一致性，尤其以厄他培南平板一致性更好。肉汤增菌法虽为美国CDC推荐筛查方法，但其操作复杂、检测周期较长，不适用于大量筛查。而商品化的CHROMagar KPC培养基由于价格昂贵，临床难以大规模推广。在现有报道中，鲜有评价自制平板性能并采用临床标本验证，且与肉汤增菌法及商品化方法的结果进行一致性评价报道。本实验后期仍需增加样本数量及类型进一步验证其筛查性能。