关于两种伊红染液在HE 染色中的选择探讨

何璋海

（中山大学孙逸仙纪念医院，广东 广州）

0 引言

苏木精-伊红染色法，简称HE 染色，业界最常用的一种组织学染色法，E 代表Eosin,伊红，作用是显示细胞浆、肌纤维、胶原纤维、嗜酸性颗粒、红细胞等组织呈现不同程度的红色或粉红色，与胞核染料苏木精在色泽上形成鲜明的红蓝对比，从而清晰的显示出组织与细胞的形态结构[1]。但实际工作中，使用醇溶性伊红进行染色，胞浆、肌纤维等结缔组织容易出现伊红过染或者染色不均的现象，主要是由于其分化程度难以掌握，导致核浆对比模糊，而且它挥发性强，性价比不高，不太符合大批量HE 片的制作。针对存在的问题，我们用改良型水溶性伊红液和醇溶性伊红液进行对比染色，报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器

德国Leica 公司的ST5020 全自动HE 染色机。

1.2 试剂

改良型Harris`苏木素、0.5%改良型水溶性伊红液、0.5%醇溶性伊红液、1%盐酸酒精、75%酒精、85%酒精、95%酒精、无水乙醇、苯酚二甲苯混合液[2]、二甲苯。

1.3 试剂配制

1.3.1 0.5%改良型水溶性伊红液

水溶性伊红粉末 2.5g，将其溶于500mL 蒸馏水，充分溶解，过滤。临用前 每440mL 水溶性伊红液滴加240 微升冰醋酸，充分混匀。

1.3.2 0.5%醇溶性伊红液

醇溶性伊红粉末2.5g，溶于500mL95%酒精，充分溶解，过滤，临用前每440mL 醇溶性伊红液滴加4 滴（约40 微升）冰醋酸。

1.3.3 改良型Harris`苏木素

将苏木精5g 溶于50mL 无水乙醇，硫酸铝钾100g 溶于1000mL 蒸馏水中，煮沸溶解，然后将两液均匀混合至染液呈淡红色，继续加热煮沸后取出，待30s 后缓慢加入氧化汞，待染液呈深紫色立即置入冰水中，待冷却至室温后过滤[3]。临用前每440mL 苏木素添加15mL 冰醋酸，充分混匀。

1.4 染色方法

应用我科的常规活检组织切片分成A、B 两组，置于70°c烤箱烤片20min,然后分别在全自动染色机上作HE 染色，但是两种伊红染液将设置不同的程序进行染色，如下：

A 组：（1）二 甲 苯5min×2；（2）95% 酒 精5min×2；（3）85% 酒 精3min×1；（4）75% 酒 精1min×1；（5）自 来 水 洗30s×1；（6）改良型Harris` 苏木素2min×1；（7）自来水洗5s×1；（8）1%盐酸酒精3s×1；（9）自来水洗10min×1；（10）0.5%改良型水溶性伊红50s×1；（11）自来水洗6s×1；（12）75% 酒 精3s×1;（13）85% 酒 精3s×1;（14）95% 酒 精5s×1；（15）苯酚二甲苯5min×2；（16）二甲苯2min×3。

B 组：（1）二 甲 苯5min×2；（2）95% 酒 精5min×2；（3）85% 酒 精3min×1；（4）75% 酒 精1min×1；（5）自 来 水 洗30s×1；（6）改 良 型Harris` 苏 木 素2min×1；（7）自 来 水 洗5s×1；（8）1%盐酸酒精3s×1；（9）自来水洗10min×1；（10）0.5%醇溶性伊红50s×1；（11）75%酒精3s×1;（12）85%酒精3s×1;（13）95%酒精5s×1；（14）苯酚二甲苯5min×2；（15）二甲苯2min×3。

程序完成后，取出染片，用中性树胶封片。

2 实验结果

2.1 0.5%改良型水溶性伊红液实验组

HE 染色结果显示胞浆、肌纤维、胶原纤维及嗜酸性颗粒、红细胞等组织呈现不同程度的红色或粉红色，颜色鲜艳，与蓝色的细胞核对比清晰,层次分明。

2.2 0.5%醇溶性伊红液实验组

HE 染色结果显示颜色稍微暗哑，部分染片伊红着色不均，核浆对比不太清晰。

图1 0.5%醇溶性伊红染色液 肠组织 10X0.25 倍镜下图

图2 0.5%水溶性伊红染色液 肠组织 40X0.65 倍镜下图

两种伊红染液的优缺点对比情况

3 讨论

通过实验可以发现0.5%改良型水溶性伊红液配制简便，不易挥发，着色速度快，染色时间容易控制，组织染色均匀，颜色鲜艳。而0.5%醇溶性伊红液配制繁琐，易挥发，分化节点难控制，容易造成组织染色不均及颜色暗哑，这是归因于染片前面经过水洗蓝化，水分或多或少带到醇溶性伊红这缸染液，随着染片量的增多，浓度会不断稀释，加上后续的75%酒精、85% 酒精都会对其起到褪色作用，因此醇溶性伊红液的分化程度会比水溶性伊红难以掌握，还有它的挥发性强，每次染片前都需要补液，经济性上也比水溶性伊红要差。对于制片工作量大的科室来说，寻找一种高效稳定、性价比高的伊红染液实属必要，而我们对传统型的水溶性伊红作出改良配制，同样可以制作出核浆对比清晰、红蓝色彩艳丽、层次分明的优质HE 片，纵观伊红液的染色原理得知其属于酸性染料，在水中电离成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷结合而使胞质染色，所以合理利用冰醋酸来调节伊红液的PH 值更是胞浆染色是否艳丽的关键步骤，量不足，伊红仅通过渗透或弥散作用，伊红很难着色，而且与组织结合不牢固，分化后容易褪色；过量，则使染色体也发生电离导致其带正电，造成核浆对比不清，另一方面也会抑制伊红电离导致沉淀，染色失效[4]。

总之，控制好添加冰醋酸的量，改善染色程序，同样可以使廉价、配制简单的水溶性伊红做到高效地解决染色不均、核浆对比不清晰等问题，另外，随着浸染式染色平台在各家医院病理科的推广使用，因其成本相对低以及试剂开放等特点[5]，在保证医疗质量的同时还能提高效益性，特别适用于大批量机染的制作单位。