枳术方对慢传输型便秘大鼠结肠5-HT4R及下游CaM-MLCK信号通路的影响

吴旻娜,王浩,李悠然,王微,谷云飞,贡钰霞

(南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029)

慢传输型便秘(Slow transit constipation,STC)是一种以排便周期延长为临床表现的难治性疾病[1],多由结肠动力障碍引起,发病率高[2],严重影响人类的生活质量。

STC的具体发病原因仍不清楚,研究认为STC与多种机制相关,如Cajal间质细胞功能异常、结肠平滑肌细胞收缩异常、肠神经系统紊乱、神经递质释放异常等[3-4]。枳术方源于李东垣《脾胃论》中记载的“枳术丸”,课题组前期发现应用枳术丸加减治疗便秘临床有效[5]。进一步通过动物实验[6]和临床剂量摸索[7]发现生白术70 g配伍枳实30 g的促肠道作用最强,能明显改善STC患者的便秘症状[8]。课题组将生白术70 g配伍枳实30 g命名为枳术方,已经获得国家专利(专利号:ZL201510090036.8)。

5-羟色胺4受体(5-HT4R)与胃肠运动功能关系密切,是胃肠功能障碍治疗的主要靶点[9],其下游钙调蛋白(Calmodulin,CaM)-肌球蛋白轻链激酶(Myosin light chain kinase,MLCK)信号通路在胃肠动力方面的作用越来越受到关注[10-12]。我们前期研究初步发现枳术方能显著上调STC大鼠结肠5-HT4R的表达[13],促进肠道蠕动。因此,进一步研究枳术方对STC大鼠5-HT4R及其下游CaM-MLCK信号通路的影响有利于阐明枳术方治疗STC的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SD大鼠50只,6～8周龄,体质量(200±20)g,雌雄各半,购自浙江维通利华实验动物技术有限公司,饲养于南京中医药大学附属医院动物实验室。生产许可证号：SCXK(浙)2019-0001。本实验经过实验动物伦理委员会审批(伦理批件号:2019DW-02-03),所有操作均遵循伦理委员会指导规定进行。

1.2 实验药物与试剂

复方地芬诺酯片(每片25 mg,常州康普药业有限公司)。琥珀酸普芦卡必利片(每片2 mg,西安杨森制药有限公司)。兔抗5-HT4R多克隆抗体(21165-1-AP,武汉三鹰生物技术有限公司)。兔抗CaM多克隆抗体(货号：10541-1-AP,武汉三鹰生物技术有限公司)。兔抗MLCK多克隆抗体(货号：21642-1-AP,武汉三鹰生物技术有限公司)。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(货号：SA5-35571，上海赛默飞世尔科技有限公司)。

枳术方由生白术70 g、枳实30 g组成,购自江苏省中医院中药房。枳术方煎煮方法:中药饮片加水煎煮2次,第1次、第2次分别加1 000、800 mL蒸馏水,每次煎煮1 h,合并煎液后静置滤过,将滤液浓缩至100 mL后分装灭菌,置于4 ℃冰箱中备用。

1.3 分组与造模

将50只大鼠按照《实验动物管理条例》适应性饲养1周。正常组15只,造模组35只。STC模型大鼠建立方法[14]:以1 mg·mL-1复方地芬诺酯混悬液按15 mg·kg-1·d-1连续灌胃21 d。造模评估:造模结束后禁食不禁水24 h,正常组和模型组各取5只大鼠,根据粪便含水量及肠道传输功能验证造模成功与否。造模过程中无大鼠死亡。

造模成功后,将模型组大鼠按数字表法随机分为模型组、枳术方组、阳性药(普芦卡必利)组,每组10只,另正常组10只大鼠。4组大鼠喂养2周后同期处理并检测各项指标。①正常组:予以正常饮食饮水。②模型组:同正常组。③枳术方组:予以100 g体质量中药煎剂灌胃0.9 mL,连续给药2周。④阳性药组:每100 g体质量予以0.018 mg·mL-1普芦卡必利悬液灌胃1 mL,连续给药2周。大鼠给药量参照人与动物之间体表面积比例折算,相当于70 kg体质量正常成人的用药量[15]。

1.4 粪便含水量和肠道炭末推进率

粪便含水量测定:末次给药后分别收集各组大鼠10粒粪便(10:00至11:00 am),称量粪便湿质量后,放入烘箱,以150 ℃烘烤15 min后称取粪便干质量,粪便含水量=(湿粪质量-干粪质量)/湿粪质量×100%。

肠道炭末推进率测定:末次给药后禁食不禁水24 h,给予10%活性炭悬液2 mL,40 min后,按30 mg·kg-1剂量腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液麻醉后,脱颈处死大鼠。迅速打开腹腔,摘出幽门至直肠末端的所有肠管,置于工作台上,拉直肠管,在松弛状态下测量幽门至炭末前沿的距离和肠道全长,肠道炭末推进率=活性炭悬液前沿至幽门的距离/肠道总长度×100%。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 标本采集 处死大鼠后立即打开腹腔,取近端结肠组织(距盲肠约2 cm)2段,每段长约1.5 cm。生理盐水冲洗干净后,1段置于4%多聚甲醛溶液中固定,用于免疫组化检测。另1段放入-180 ℃液氮中,5 h后转移到-80 ℃冰箱冻存,用于qPCR及Western blot检测。

1.5.2 免疫组化检测结肠组织5-HT4R、CaM和MLCK的表达 结肠组织经4%多聚甲醛溶液中固定24 h后,梯度酒精脱水,浸蜡,包埋,切片。切片脱蜡水化,柠檬酸缓冲液高压抗原修复喷气2 min,冷却至室温。PBS液冲洗,用山羊血清封闭,室温孵育10 min,弃血清,分别滴加一抗5-HT4R、CaM和MLCK,4 ℃冰箱过夜。PBS液冲洗,滴加快速免疫组化MaxVisonTM二抗,室温孵育15 min,PBS液冲洗。加入新鲜配制的DAB显色剂,避光显色2 min,充分冲洗后苏木素复染,冲洗返蓝。梯度酒精脱水、二甲苯透明,中性树胶封片。显微镜下观察,拍照。

1.5.3 qPCR检测结肠组织5-HT4R、CaM和MLCK mRNA含量 取约100 mg冻存的结肠组织,采用Trizol法提取结肠组织总RNA,紫外分光光度法检测其纯度和浓度,将总RNA逆转录为cDNA。GAPDH、5-HT4R、CaM、MLCK引物由上海英俊生物技术有限公司合成。见表1。将逆转录完成的cDNA稀释后分别进行基因扩增,并以GAPDH为内参。扩增条件:94 ℃,2 min,94 ℃,15 s,60 ℃,15 s,72 ℃,15 s,40个循环;72 ℃,10 min。采用2-ΔΔCt法对结果进行分析。

表1 引物序列

1.5.4 Western blot检测结肠组织5-HT4R、CaM和MLCK蛋白表达 取-80 ℃储存的结肠组织,每份取0.5 g加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂后匀浆机匀浆,离心,取上清液为提取的总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度,按蛋白浓度加入上样缓冲液,煮沸变性。制胶,上样及电泳,转膜,含脱脂奶粉的TBST封闭液常温封闭1～2 h。按抗体说明书分别加入1∶1 000稀释的GAPDH、5-HT4R、CaM、MLCK一抗4 ℃孵育过夜。一抗孵育完成后,TBST洗涤,加入1∶4 000稀释的羊抗兔IgG-HRP二抗孵育1～2 h,TBST洗涤。ECL显色剂显影,于凝胶成像仪中进行曝光成像,并测定条带灰度值,计算目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的相对表达量。

1.6 统计与分析

2 结果

2.1 各组大鼠粪便含水量、肠道炭末推进率比较

与正常组比较,模型组大鼠粪便含水量、炭末推进率显著降低(P<0.01);与模型组比较,枳术方组和阳性药组大鼠粪便含水量、炭末推进率显著升高(P<0.05);枳术方组与阳性药组之间无显著差异(P>0.05)。见图1。

注:与正常组比较，**P<0.01;与模型组比较,图1 各组大鼠粪便含水量和炭末推进率比较

2.2 各组大鼠5-HT4R、CaM、MLCK蛋白免疫组化表达比较

5-HT4R、CaM、MLCK阳性表达均呈棕黄色或棕褐色,主要存在于结肠黏膜层、黏膜下层和肌层。镜下观察发现,与正常组比较,模型组5-HT4R、CaM、MLCK蛋白表达水平明显降低。与模型组比较,枳术方组、阳性药组5-HT4R、CaM、MLCK蛋白水平表达均升高。在枳术方组和阳性药组间未见明显差异。见图2。

图2 各组大鼠5-HT4R、CaM、MLCK免疫组化图(×400)

2.3 各组大鼠5-HT4R、CaM、MLCK的mRNA表达水平比较

与正常组比较,模型组大鼠结肠5-HT4R、CaM、MLCK mRNA表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,枳术方组、阳性药组大鼠结肠5-HT4R、CaM、MLCK mRNA表达水平显著上调(P<0.05，P<0.01)。枳术方组与阳性药组之间无显著性差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠结肠5-HT4R、CaM、MLCK mRNA相对表达水平比较

注:与正常组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05，##P<0.01。

2.4 各组大鼠5-HT4R、CaM、MLCK的蛋白表达的比较

Western blot结果显示:与正常组比较,模型组大鼠结肠5-HT4R、CaM、MLCK蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较,枳术方组和阳性药组大鼠结肠5-HT4R、CaM、MLCK的蛋白表达水平显著升高(P<0.05，P<0.01)。枳术方组与阳性药组之间无显著性差异(P>0.05)。见图3。

3 讨论

STC病人病程不稳定,而现代社会泻剂的滥用导致病人结肠受损、肠道扩张、治疗愈发困难。枳术方治疗STC临床疗效较明确[7-8],长期服用安全性高,能弥补西药在治疗STC方面的不足,体现了中医药治疗STC的优势。进一步探索枳术方治疗STC的作用机制对于其临床应用具有重要意义。

5-HT主要分布于胃肠道,参与调节胃肠道运动功能,其效应主要通过5-HT受体介导。5-HT受体有7个亚型,其中5-HT4R与结肠动力障碍关系密切,其表达下降影响肠道蠕动,是STC发病的重要机制之一[9]。5-HT4R是G蛋白偶联受体,主要分布于结肠平滑肌细胞、上皮细胞和神经元,激活后可以通过改变细胞内外Ca2+浓度并进一步激活下游信号通路，使结肠平滑肌细胞收缩,从而调节结肠平滑肌的运动。据报道,5-HT4R激活的下游信号通路主要包括CaM-MLCK通路、cAMP-PKA通路、RhoA-Rho激酶通路等[10,16-18]。5-HT4R引起结肠平滑肌细胞收缩，激活了较多的下游信号通路,其中CaM-MLCK通路是调节平滑肌细胞收缩的经典信号通路[19],与5-HT4R关系密切。Kyung等[20]报道5-HT与5-HT4R结合诱导的猫食管平滑肌细胞收缩是通过激活下游CaM-MLCK通路引起的,DA-9701抑制平滑肌细胞的收缩是通过抑制MLCK下游肌球蛋白轻链(20 kD of myosin light chain,MLC20)的磷酸化导致。

注:与正常组比较，**P<0.01;与模型组比较,图3 各组大鼠5-HT4R、CaM、MLCK蛋白表达的比较

CaM-MLCK通路又称为粗肌丝相关调节通路,作为调节平滑肌细胞收缩的核心通路,在结肠平滑肌细胞动力信号传导中起关键作用。CaM是一种多功能调节蛋白,是细胞内Ca2+信号传导途径中主要的信号传导分子,参与和调控Ca2+引起的系列生化反应,介导并调节细胞的增殖、运动等活动[21]。5-HT4R活化后作用于平滑肌细胞膜,激活Ca2+离子通道,使细胞内游离Ca2+浓度迅速升高并与CaM结合形成Ca2+-CaM复合物,继续激活MLCK。MLCK是一种依赖于Ca2+-CaM复合物的激酶,广泛分布于平滑肌等肌肉组织,被激活的MLCK使MLC20上第19位的丝氨酸残基磷酸化,MLC20磷酸化后激活平滑肌肌球蛋白ATP水解酶水解ATP,将化学能转换成机械能,使肌球蛋白能够沿着肌动蛋白丝滑动,从而实现肌肉的收缩[22]。MLCK在这一信号途径中发挥作用的区域位于中心激酶区,是目前胃肠平滑肌细胞收缩机制研究的重要靶点[19,23]。从肌源性角度探讨枳术方对STC大鼠结肠动力的影响具有重要意义。

本实验中,枳术方对STC大鼠粪便含水量、肠道传输功能有显著改善作用,与普芦卡必利疗效相当。普芦卡必利是一种高选择性5-HT4R激动剂,临床广泛用于STC的治疗。在促进5-HT4R表达方面,枳术方与普芦卡必利疗效相当,这在我们前期实验中已经得到证实[8],本实验证明了5-HT4R是枳术方作用的靶点之一。模型组大鼠结肠5-HT4R、CaM、MLCK的mRNA水平和蛋白表达水平均较正常组显著下降(P<0.05),而在枳术方给药后显著恢复(P>0.05),CaM-MLCK通路作为5-HT4R的下游信号通路,CaM、MLCK的表达与5-HT4R表达呈正相关,说明枳术方可能通过上调大鼠结肠5-HT4R表达而激活下游CaM-MLCK通路,从而促进结肠平滑肌细胞收缩，加速肠道蠕动,发挥改善STC症状的作用。