溃疡性结肠炎脾气虚证患者代谢特征研究

连紫宇,朱磊,刘亚军,胡静怡,程成,沈洪

(南京中医药大学附属医院,江苏 南京 210029)

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种慢性肠道炎症,当前研究表明其发病机制与机体遗传易感性和外界因素引起的免疫功能紊乱有关[1]。中医证候研究是中医现代化的关键环节,证候的准确辨识是临床论治有效的前提[2],因此,建立客观的证候诊断标准,对于提高中医的临床诊疗水平具有重要的意义。

素体脾胃虚弱是UC的发病基础,且脾虚证候的演变和转归影响着疾病的发生、发展过程,但目前UC脾气虚证的研究仍然存在诊断标准不统一、主观指标过多、辨证方法单一、生物学内涵不清、可操作性差等不足,阻碍了中医证候研究的规范化和现代化,因此深入研究UC脾虚证的生物学本质,探索其生物学基础对于该病的早期预防和治疗意义重大。UC以活动期和缓解期反复交替发作为主要特征，当前研究认为UC活动期以湿热蕴肠为主要病机，缓解期以脾气虚弱为主要病机，湿热证和脾虚证是UC临床最常见的证候，因此本研究将UC湿热证和脾气虚证进行比较，观察UC脾气虚证的特征性表现。

代谢组学是20世纪90年代末发展起来的一项研究手段,能够定量化、动态化分析机体内源性小分子代谢物的变化。生理条件下机体代谢处于动态平衡中,当受到病理因素影响时机体内代谢产物水平出现异常变化,代谢稳态被破坏并影响疾病的发生发展。已有研究发现UC患者的氨基酸代谢、脂质代谢与健康人存在差异,表明代谢紊乱与UC的发生发展有关[3]。此外,脾为气血生化之源,具有消化食物运送水谷精微至全身的作用。现代医学认为,机体通过物质代谢从外界摄取营养物质,同时经过体内分解吸收将其中蕴藏的化学能释放出来，转化为组织和细胞可以利用的能量以维持生命活动。因此有学者提出,中医理论中脾主运化、主升清、化生气血的功能与现代医学描述的生物体代谢过程极为相似[4]。为了探索UC脾气虚证与代谢改变的内在关联，本研究以UC脾气虚证患者为研究对象，以健康对照人群和UC湿热证为对照，利用代谢组学技术表征UC脾气虚证，以探索UC脾气虚证的生物学本质。

1 临床资料

1.1 一般资料

收集2020年5月至2020年12月于江苏省中医院就诊的UC患者61例,其中辨证为脾气虚证者31例,辨证为湿热证者30例,同时收集于江苏省中医院进行体检的健康对照组27例。本研究已通过江苏省中医院伦理委员会审查批准(批件号:2019NL-097-04)。如表1所示,3组患者性别、年龄未发现统计学差异,基线具有一致性。

表1 2组基线资料比较

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 溃疡性结肠炎参照《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2018年 北京)》[5]诊断标准,结合临床表现、实验室检查、影像学检查、内镜和组织病理学表现进行综合分析,在排除感染性和其他非感染性结肠炎的基础上做出诊断。

1.2.2 中医辨证标准 参照国家中医药管理局发布的《中医病证诊断疗效标准》[6]、中华中医药学会发布的《中医内科常见病诊疗指南》[7]和《溃疡性结肠炎中医诊疗专家共识意见(2017)》[8]中脾气虚证、湿热证辨证标准,由2名接受过严格培训的副高以上中医师辨证。

UC脾气虚证。主症:①黏液脓血便,白多赤少,或为白冻;②腹泻便溏,夹有不消化食物;③脘腹胀满。次症:①腹部隐痛;②肢体困倦;③食少纳差;④神疲懒言。舌脉:①舌质淡红,边有齿痕,苔薄白腻;②脉细弱或细滑。

UC湿热证。主症:①腹泻,便下黏液脓血;②腹痛;③里急后重。次症:①肛门灼热;②腹胀;③小便短赤;④口干;⑤口苦。舌脉:①舌质红,苔黄腻;②脉滑。

1.3 纳入标准

1.3.1 溃疡性结肠炎受试者 ①符合溃疡性结肠炎西医诊断标准;②中医辨证为湿热证或脾气虚证;③年龄在18～70岁之间;④患者知情并签署知情同意书。

1.3.2 健康受试者 ①在本院体检的健康志愿者;②年龄在18～70岁之间,性别不限;③体格检查,血白细胞计数,谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr),心电图、胸片检查均在正常范围;④知情同意,自愿受试,获得知情同意书过程应符合伦理原则。

1.4 排除标准

1.4.1 溃疡性结肠炎受试者 ①妊娠期、哺乳期妇女;②具有严重的原发性心、肝、肺、肾、造血系统等疾病;③由于智力或行为障碍不能给予充分知情同意者;④怀疑或确有酒精、药物滥用病史;⑤原发性、继发性感染性疾病患者,如胆囊炎,肺炎等。

1.4.2 健康受试者 ①粪常规检查异常;②近1月内出现腹痛、腹泻症状;③妊娠期、哺乳期妇女;④具有严重的原发性心、肝、肺、肾、造血系统等疾病;⑤由于智力或行为障碍不能给予充分知情同意者;⑥怀疑或确有酒精、药物滥用病史;⑦具有原发性、继发性感染性疾病患者,如胆囊炎、肺炎等;⑧具有炎症性肠病家族史者。

2 方法

2.1 血清样本采集

受试者空腹肘静脉采血3 mL于采血管中,室温静置2 h,待样本分层后吸取上清至新的EP管中,3 000 r·min-1,4 ℃条件下离心20 min,吸取上清置于新的EP管中,-80 ℃条件下保存。

2.2 样本前处理

取50 μL离心后的血清于1.5 mL RNAfree EP管中,加入550 μL色谱级甲醇,充分震荡15～20 min;15 000 r·min-1,4 ℃条件下离心10 min,吸取500 μL上清于新的1.5 mL RNAfree EP管中;真空、室温条件下挥干液体,观察管底部沉淀;管中加入100 μL色谱级甲醇复溶,18 000 r·min-1,4 ℃条件下离心10 min,吸取上清于新的1.5 mL RNAfree EP管中,后再次18 000 r·min-1,4 ℃条件下离心10 min,吸取60 μL上清于进样管中待测[9]。

2.3 色谱质谱条件

色谱条件:采用UPLC/MS SYNAPT G2-Si配有Waters ACQUITY UPLC H-Class液相色谱系统进行色谱分析,色谱柱采用Waters Atlantis T3柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm),流动相A为60%乙腈(含有0.1%甲酸),流动相B为90%异丙醇(含有0.1%甲酸),设置流速为0.4 mL·min-1,柱温为55 ℃。采用梯度洗脱以进行色谱分离,梯度洗脱条件如下:0～2 min,60%A;2～2.1 min,57%A;2.1～12 min,50%A;12～12.1 min,60%A;12.1～18 min,60%A;18～18.1 min,60%A;18.1～20 min,60%A。

质谱条件:采用电子喷雾离子源,正离子模式检测,扫描采用Sensitivity模式,数据采集采用IDA模式,扫描范围为m/z350～1 000。具体质谱参数如下:质量范围50～1 200;扫描时间0.15 s;碰撞电压20～50 V;碰撞能量40 V。采用Lock Sray进行自动校准。

2.4 代谢物鉴定

将质谱分析所得数据导入Progenesis QI(Waters,Milford,USA)工作站中,用内标将所得数据进行校正,得到一个包含前体离子m/z并保留时间和峰面积的多元数据矩阵。将包含前体离子m/z、保留时间和峰面积的多元数据矩阵与Human Metabolome Database数据库(https://hmdb.ca/textquery)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes数据库(https://www.kegg.jp/)进行比配鉴定,软件自动给出样品中化合物的鉴定结果。导入EZinfo数据处理软件中进行偏最小二乘判别分析,将Max fold change>2的候选化合物通过提取离子色谱峰并手动检查后,剔除假阳性结果。筛选Abundance>1 000,P<0.05的化合物,并且手动剔除无碎片匹配或碎片匹配不合理的化合物,对筛选出的化合物进行匹配鉴定和含量分析。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 疾病特征比较

2组间病程、病变范围、血沉未发现统计学差异,UC脾气虚证组C反应蛋白、粪钙卫蛋白水平低于UC湿热证组,但差异无统计学意义。见表2。

表2 疾病特征

3.2 PLS-DA分析

结果如图1所示,3组间具有一定的差异性。

注:HC.健康对照组;PX.UC脾气虚证组;SR.UC湿热证组图1 溃疡性结肠炎患者血清代谢物PLS-DA分析

3.3 差异代谢物筛选与鉴定

将健康对照、UC湿热证、UC脾气虚证3组血清代谢物丰度Top40进行热图分析,如图2所示,3组间代谢物分布差异明显,与健康组比较,UC患者血清中磷酸胆碱、溶血磷脂、硬脂酰胺、尿酸等代谢物丰度升高,进一步不同证候间比较发现,UC脾气虚证患者血清中上述代谢物丰度均低于UC湿热证者。

3.4 溃疡性结肠炎脾气虚证与湿热证患者血清差异代谢物

进一步分析3组间差异具有统计学意义的代谢产物,结果显示,与健康对照组比较,UC脾气虚证组1-油酰基甘油磷酸胆碱、溶血磷脂、鞘氨醇、N-棕榈酰磷酸乙醇胺、棕榈酰肉碱、O-花生四烯酰缩水甘油、2-亚油酰甘油丰度升高,二十二碳三烯酸、棕榈酰胺丰度降低,与UC湿热证患者比较,上述代谢物中2-亚油酰甘油丰度在UC脾气虚证组升高,其余代谢物丰度均降低,提示UC脾气虚证的发生发展可能与上述代谢物丰度的变化有关。见图3。

3.5 ROC曲线分析

采用ROC曲线评估血清代谢产物对于UC脾气虚证的诊断价值，结果如图4～5所示,O-花生四烯酰缩水甘油、棕榈酰胺、2-亚油酰甘油在UC脾气虚证中ROC曲线下面积高于湿热证,提示上述3种代谢物可能是诊断UC脾气虚证的潜在指标。此外,多因素联合诊断ROC曲线结果显示,棕榈酰胺和2-亚油酰甘油联合诊断UC脾气虚证效应优于单因素诊断和其他组合的多因素诊断,提示棕榈酰胺和2-亚油酰甘油联合在诊断UC脾气虚证方面具有一定潜力。见图4～5。

4 讨论

已有大量研究证实UC的发生发展与代谢紊乱密切相关,Scoville等[3]比较炎症性肠病(IBD)患者和健康人的血清代谢产物,结果发现IBD患者体内与脂质代谢、氨基酸代谢和三羧酸循环相关的多种代谢物发生了显著改变。本研究结果显示,UC患者血清中1-油酰基甘油磷酸胆碱、溶血磷脂、鞘氨醇、N-棕榈酰磷酸乙醇胺、棕榈酰肉碱、花生四烯酸甘油、2-亚油酰甘油等代谢产物丰度高于健康对照组,二十二碳三烯酸丰度低于健康对照组,提示UC患者存在脂质代谢紊乱,与文献报道结果一致。

进一步比较UC脾气虚证和湿热证血清代谢产物差异,结果显示,与UC湿热证患者比较,UC脾气虚证组血清中1-油酰基甘油磷酸胆碱、溶血磷脂、鞘氨醇、棕榈酰肉碱、O-花生四烯酰缩水甘油等代谢产物丰度降低,2-亚油酰甘油丰度升高。1-油酰基甘油磷酸胆碱是一种溶血磷脂,溶血磷脂是一类具有较强表面活性的磷脂,能使红细胞及其他细胞膜破裂,引起溶血或细胞坏死,生理条件下,体内磷脂酶的存在位置和数量受到严格控制,因此机体并不会受到伤害[10]。经过磷脂酶B作用脱去脂肪酸后,溶血磷脂转变成甘油磷酸胆碱或甘油磷酸乙醇胺,即失去溶解细胞膜的作用[11]。

注:HC.健康对照组;PX.UC脾气虚证组;SR.UC湿热证组;与HC组比较,#P<0.05,##P<0.01;与PX组比较,*P<0.05,**P<0.01。图3 溃疡性结肠炎不同证型患者血清差异代谢物

注:A～C.O-花生四烯酰缩水甘油、棕榈酰胺、2-亚油酰甘油在UC脾气虚证中的ROC曲线图;D～F.O-花生四烯酰缩水甘油、棕榈酰胺、2-亚油酰甘油在UC湿热证中的ROC曲线图图4 差异代谢物的ROC曲线图

注:1.O-花生四烯酰缩水甘油;2.棕榈酰胺;3.2-亚油酰甘油图5 多因素ROC曲线

研究发现,1-油酰基甘油磷酸胆碱可以升高内皮细胞黏附分子和生长因子表达,促进单核细胞趋化,从而促进炎症反应[12]。棕榈酰肉碱是长链脂肪酸衍生物,可通过改变膜的流动性和表面电荷在脂肪酸氧化过程中促进长链脂肪酸从细胞质向线粒体的转移,是脂肪酸跨线粒体内膜运输并参与β氧化的重要介质[13]。二十二碳三烯酸属于极长链多不饱和脂肪酸,可以降低IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达以发挥抑制炎症的作用[14]。本研究结果显示，UC湿热证患者血清中1-油酰基甘油磷酸胆碱、肉桂酸、二十二碳三烯酸的丰度均高于脾气虚证，提示湿热证患者存在较为严重的炎症反应。

ROC曲线结果显示,O-花生四烯酰缩水甘油、棕榈酰胺、2-亚油酰甘油可能是诊断UC脾气虚证的潜在生物标志物。花生四烯酸是结合和激活内源性大麻素受体1和2的内源性信号脂质,且内源性大麻素受体的激活具有改善结肠炎症的作用,而机体内花生四烯酸和内源性大麻素受体的水平受到脂肪酸酰胺水解酶的调控。O-花生四烯酰基缩水甘油是脂肪酸酰胺水解酶的抑制剂[15],研究发现,脂肪酸酰胺水解酶抑制剂可缓解葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的实验性肠炎小鼠体质量减轻和炎症反应[16],TNBS诱导的结肠炎大鼠体内脂肪酸酰胺水解酶缺乏或抑制可导致内源性花生四烯酸水平升高,促炎细胞因子水平降低[17]。2-亚油酰甘油是一种单酰基甘油酯,由甘油分子3个羟基中的1个羟基和2个脂肪酸酯化而成。目前研究较多的单酰基甘油酯为2-花生四烯酰甘油,2-花生四烯酰甘油是机体主要的内源性大麻素,是花生四烯酸的前体,通过作用于大麻素受体来调节突触神经传递[18]。近年来2-亚油酰甘油在果蝇体内和小鼠脑、脾和肠道中被发现,并且有研究报道2-亚油酰甘油可以通过影响Akt和ERK激酶级联剂量依赖性地抑制神经元分化[19]。棕榈酰胺是来自棕榈酸的初级脂肪酸酰胺,关于初级脂肪酸酰胺在生物体中的产生和降解机制至今尚未阐明,目前认为脂肪酸酰胺与内源性大麻素竞争结合酶的活性位点,并且可以增加内源性大麻素的浓度[20]。以上3种代谢产物都与内源性大麻素系统有关,内源性大麻素系统包括大麻素受体、内源性配体以及合成或降解酶类组成,具有调节神经系统、缓解疼痛、调节心血管功能的作用,已有研究证实,激活大麻素受体1和2可以缓解肠道炎症,内源性大麻素系统发挥缓解肠道炎症作用可能与调节胃肠道动力和内脏高敏感有关,本研究结果显示O-花生四烯酰缩水甘油、棕榈酰胺和2-亚油酰甘油对UC脾气虚证的诊断效能更高,提示UC脾气虚证和湿热证的微观生物学基础可能与内源性大麻素系统有关。

代谢组学以客观化的数据阐释了脾气虚证患者代谢改变的轮廓和差异代谢物,提示UC脾气虚证与脂质代谢紊乱有关。脾气虚弱是UC发病的基础,应用组学技术得出的客观化、微观化指标表征UC脾气虚证有助于阐明其生物学本质,为疾病的早期预防和治疗提供参考和证据支撑。

在后续研究中，可以进行多中心、大样本的随机对照研究,以获得证据等级更高的临床研究结果,并应用代谢组学、蛋白组学、宏基因组学等多组学方法,全面探究中医证候的生物学本质,进一步推进中医药的现代化发展。