基于TGF-β1/Smad通路探究补肾化瘀方对宫腔粘连大鼠子宫内膜纤维化的作用及机制*

李 姣，林 洁，易星星，邱冉冉

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

宫腔粘连（intrauterine adhesion，IUA）也称为Asherman综合征，是指子宫内膜基底层损伤后，功能层再生修复障碍及过度纤维化，正常组织被纤维组织所取代，宫腔部分或完全封闭的一种疾病，清宫术是导致IUA的主要原因之一[1-2]。由于IUA可导致妊娠早期反复流产、早产、产后出血等不良妊娠结局，给育龄期女性的生殖生理健康带来较大损伤。因此，改善IUA、恢复子宫功能，是当前IUA临床治疗亟待解决的关键问题[3]。目前，中医药作为治疗IUA的主要手段之一，具有多成分靶点、防治结合的特点[4]。中医临床治疗IUA多以补肾、活血、化瘀为基本治疗原则[5-6]。已有多项研究表明，补肾化瘀法治疗IUA有显著疗效，能够促进患者子宫内膜修复，降低宫腔再粘连率，改善妊娠结局，提高生活质量，但其作用机制尚不清楚[7-8]。因此，本研究拟建立大鼠IUA模型，观察补肾化瘀方对IUA大鼠子宫内膜纤维化的改善作用，探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄SPF级SD大鼠75只，健康未孕雌性，体质量160～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。饲养条件为室温（22±1）℃，湿度（50±10）%，每天定时换气，保持12 h∶12 h光暗照明，自由采食、饮水，实验结束后麻醉处死全部大鼠。本实验通过湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会批准，批准号：HNZYYDXDYFSYY20190325。

1.2 药物与试剂 补肾化瘀方，方药组成：紫石英15 g，补骨脂8 g，菟丝子8 g，桑寄生8 g，茺蔚子5 g，泽兰8 g，泽泻8 g，土鳖虫8 g，三七3 g，覆盆子8 g，莲子心3 g，甘草3 g，由本院药剂科制成含有生药2g/mL的药液；SRI-011381 hydrochloride（TGF-β通路激活剂）（北京百奥莱博科技有限公司，批号：M05956-EKD）；苏木素染液（批号：G1080）、伊红染色液（批号：G1100）、Masson三色染色试剂盒（批号：G1340）均购自北京索莱宝科技有限公司）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（批号：E-EL-R2856c）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA试剂盒（批号：E-EL-R0012C）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA检测试剂盒（批号：E-EL-R0896c）均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit（批号：K1621）、SYBR Green Real-Time PCR Master Mixes（批号：4309155）均购自美国Thermo scientific公司；转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）兔单抗（批号：5154）、Smad3兔单抗（批号：9523）、Smad4兔单抗（批号：46535）、p-Smad3兔单抗（批号：9520）、p-Smad4兔单抗（批号：38454）均购自美国CST公司；Smad7免单抗（批号：ab264745）、p-Smad7兔单抗（批号：ab272928）均购自艾博抗（上海）贸易有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（IgG-HRP）（上海碧云天生物技术有限公司，批号：A0208）。

1.3 主要仪器 DYCZ-24KS型双板垂直电泳仪（北京六一仪器厂）；IX53型显微镜（日本奥林巴斯）；G:BOX型多功能凝胶成像系统（Syngene）；7500型PCR仪（美国Applied biosystems）；Multiskan MK3型酶标仪（Thermo Fisher Scientific）。

1.4 造模与分组 参考文献[9]方法建立大鼠IUA模型：大鼠腹腔注射5%的水合氯醛溶液麻醉，无菌条件下于大鼠下腹正中部位纵切一长3～4 cm的切口，分离组织，暴露子宫。在距宫体交界处1 cm的左宫角横切开一微小切口，用自制的小刮勺向宫角远端搔刮左侧子宫腔4圈，搔刮长度约4 cm，待宫腔四壁有粗糙感时，停止搔刮。于宫腔内留置已备好的脂多糖棉线，同法处理右侧子宫角。生理盐水冲洗腹腔，缝合切口，留置约2 cm的棉线残端于腹部，48 h后轻拉尾丝，取出宫内棉线。另取15只大鼠作为假手术组，仅在大鼠宫颈上方做一切口，不刮宫，生理盐水冲洗腹腔后缝合。将建立IUA模型的大鼠按照随机数字表法分为模型组、补肾化瘀方组、补肾化瘀方+SRI-011381组、SRI-011381组，每组15只。

1.5 实验给药 按照前期预实验结果及人与大鼠体表面积折算等效剂量，补肾化瘀方组、补肾化瘀方+SRI-011381组大鼠灌胃给予补肾化瘀方药液，8.9 g/kg，同时，补肾化瘀方+SRI-011381组、SRI-011381组大鼠腹腔注射SRI-011381，10 mg/kg，假手术组和模型组大鼠灌胃等体积0.9%氯化钠溶液，1次/d，连续21 d。

1.6 观察指标 末次给药后24 h，各组大鼠腹腔注射5%的水合氯醛溶液麻醉，腹主动脉取血，置于4 ℃冰箱中静置3 h，3 000 r/min离心15 min，取上层血清，分装后冻存于-80 ℃冰箱中，用于ELISA试剂盒检测。分离各组大鼠子宫组织，观察形态，取右侧子宫组织于4%多聚甲醛中固定，用于HE和Masson染色，其余组织冻存于-80 ℃冰箱中，用于RT-qPCR及Western blotting检测。

1.6.1 大鼠子宫组织病理变化 将大鼠子宫组织在4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，蒸馏水清洗，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，作4 μm组织切片，二甲苯脱蜡30 min，梯度乙醇及蒸馏水中复水，HE染色，脱水、透明后中性树胶封片，光镜下观察大鼠异位灶组织病理变化，在每张HE染色切片中随机选取4个高倍镜视野，计算每个视野的腺体数量并求平均值。

1.6.2 大鼠子宫组织纤维化情况 大鼠子宫组织固定、病理切片制作、脱蜡和复水过程同“1.6.1”。按照Masson染色试剂盒的操作步骤进行染色，光镜下观察子宫组织纤维化情况，在每张Masson染色切片中随机选取4个高倍镜视野，使用Image J软件计算子宫内膜间质胶原纤维部分的面积与子宫内膜间质总面积之比，并求平均值。

1.6.3 血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平 取各组大鼠血清，严格按照ELISA试剂盒说明书步骤检测TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.6.4 子宫内膜TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA和Smad7 mRNA表达水平 取子宫组织，研磨匀浆后加入Trizol裂解液提取总RNA，使用RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒合成cDNA，作为荧光定量模版。引物序列见表1。反应条件为：95 ℃5 min，95 ℃30 s，62 ℃30 s，72 ℃30 s，扩增40个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃5 min终止反应，实验重复3次。根据2-△△CT法计算目的基因mRNA相对表达量。

表1 引物序列

1.6.5 TGF-β1/Smad通路蛋白表达水平 取子宫组织，研磨匀浆后加入裂解液提取组织蛋白，测定蛋白浓度，蛋白中加入loading buffer煮沸使之变性，按照30 μg/孔的上样量进行SDSPAGE电泳，转膜、封闭，放入各一抗稀释液（1∶1 000）中4 ℃孵育过夜，次日以TBST清洗后加入羊抗兔二抗（1∶2 000）37 ℃孵育2 h，洗膜，滴加发光液，置凝胶成像仪中显影。以GAPDH为内参蛋白，采用Image J软件分析各蛋白对应的灰度值，计算蛋白的相对表达量，蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.7 统计学方法 应用SPSS 25.0统计软件进行统计学分析，计量资料以“均数±标准差”（）表示，多样本比较采用单因素方差分析，两样本比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠子宫组织形态学观察 假手术组大鼠子宫组织的表面呈淡粉色，延展性良好，形态匀称；模型组大鼠子宫组织明显增粗，有充血现象，延展性较差；与模型组比较，补肾化瘀方组大鼠子宫的增粗现象有所减轻，粗细均匀，延展性尚可；补肾化瘀方+SRI-011381组和SRI-011381组大鼠子宫组织仍有明显增粗和充血，弹性减退。（见图1）

图1 各组大鼠子宫组织形态

2.2 各组大鼠子宫组织病理学变化比较 HE染色结果显示，假手术组大鼠子宫组织形态规则，可见清晰的内膜层、浆膜层和肌层，黏膜下层可见较多的腺体，排列整齐，无炎症细胞浸润；模型组大鼠子宫组织内膜层被破坏，结构疏松，有大量炎症细胞浸润，腺体数量明显减少（P＜0.05）；与模型组比较，补肾化瘀方组大鼠子宫内膜增厚，腺体数量增加，炎症细胞浸润减少，而SRI-011381可削弱补肾化瘀方的作用，使大鼠的子宫内膜腺体数量减少，炎症细胞浸润增加（P＜0.05）。Masson染色显示，假手术组大鼠子宫内膜间质组织仅可见少量蓝色胶原纤维；模型组大鼠子宫内膜组织可见大量的胶原纤维生成，排列紧密，纤维化面积明显增加（P＜0.05）。与模型组比较，补肾化瘀方组大鼠子宫内膜组织胶原纤维的生成减少，分布相对稀疏，纤维化面积减少（P＜0.05），而SRI-011381可削弱补肾化瘀方的作用，补肾化瘀方+SRI-011381组和SRI-011381组大鼠子宫内膜的纤维化面积均高于补肾化瘀方组（P＜0.05）。（见图2～3）

图2 各组大鼠子宫组织病理学变化（×400）

图3 各组大鼠子宫组织腺体数量及纤维化面积比较（，n=15）

2.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，补肾化瘀方组、补肾化瘀方+SRI-011381 组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低（P＜0.05），SRI-011381组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高（P＜0.05），其中补肾化瘀方+SRI-011381组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于补肾化瘀方组（P＜0.05）。（见图4）

图4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比较（，n=15）

2.4 各组大鼠子宫组织TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA和Smad7 mRNA表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠子宫组织TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表达均明显升高（P＜0.05），Smad7 mRNA表达明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，补肾化瘀方组和补肾化瘀方+SRI-011381组大鼠子宫组织TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表达均降低（P＜0.05），Smad7 mRNA表达升高（P＜0.05），SRI-011381组大鼠子宫组织TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表达均升高（P＜0.05），Smad7 mRNA表达降低（P＜0.05），其中补肾化瘀方+SRI-011381组大鼠子宫组织TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表达均高于补肾化瘀方组（P＜0.05），Smad7 mRNA表达低于补肾化瘀方组（P＜0.05）。（见图5）

图5 各组大鼠子宫组织TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA 和Smad7 mRNA 表达水平比较（，n=15）

2.5 各组大鼠子宫组织TGF-β1/Smad通路蛋白表达水平比较与假手术组比较，模型组大鼠子宫组织TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白磷酸化水平均升高（P＜0.05），Smad7蛋白磷酸化水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，补肾化瘀方组和补肾化瘀方+SRI-011381组大鼠子宫组织TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白磷酸化水平均降低（P＜0.05），Smad7蛋白磷酸化水平均升高（P＜0.05），SRI-011381 组大鼠子宫组织TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白磷酸化均升高（P＜0.05），Smad7蛋白磷酸化表达降低（P＜0.05），其中补肾化瘀方+SRI-011381组大鼠子宫组织TGFβ1、Smad3、Smad4蛋白磷酸化水平均高于补肾化瘀方组（P＜0.05），Smad7蛋白磷酸化水平低于补肾化瘀方组（P＜0.05）。（见图6～7）

图6 各组大鼠子宫组织TGF-β1/Smad 通路蛋白表达Western blotting 图

图7 各组大鼠子宫组织TGF-β1/Smad 通路蛋白表达水平比较（，n=15）

3 讨 论

近年来，IUA的发病率和检出率逐年升高，患者发病年龄亦呈年轻化趋势[10]。IUA具有子宫内膜纤维化的病理特征，而子宫内膜纤维化也是IUA的发病机制之一，防止宫腔黏膜过度纤维化具有重要意义[11-12]。IUA属中医“闭经”“断绪”“无子范畴”，先天肾气不足、房劳多产、宫腔手术等均可致肾虚，同时宫腔手术可导致子宫受损，瘀血内停，邪气趁虚而入，气血运行不畅，因而导致患者经血不通、闭经、不孕，治疗当以补肾、活血、化瘀为基本治疗原则[13-14]。补肾化瘀方中紫英石、补骨脂为君药，补肾助阳；菟丝子补益肝肾，润燥补虚；桑寄生补肝肾，安胎元；覆盆子填精补髓，疏利肾气；莲子心交通心肾，可制君药的温燥；泽兰、泽泻、茺蔚子和三七调经活血；土鳖虫破血逐瘀；甘草调和诸药。全方共奏补肾填精、活血化瘀之功效。

本研究建立了IUA大鼠模型，模型组大鼠子宫组织明显增粗，内膜层破坏，有大量炎症细胞浸润，腺体数量明显减少，纤维化面积明显增加，表明造模成功。使用补肾化瘀方治疗后，IUA大鼠子宫组织形态趋于正常，腺体数量增加、炎症细胞浸润和纤维化程度减轻，表明补肾化瘀方对IUA子宫内膜病理学改变具有改善作用。TNF-α、IL-1β、IL-6均是参与机体免疫应答、具有广泛免疫调节的促炎性细胞因子，具有促进异位内膜及间质细胞的增殖、侵袭、转移，以及促进血管生成的作用，能增加盆腔局部组织粘连及纤维化的发生率[15-16]。在本研究中，模型组大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高，使用补肾化瘀方治疗后，IUA大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，表明补肾化瘀方可减轻大鼠IUA的炎症反应。

现代研究发现，TGF-β1的水平升高常在发生不受控制的纤维化反应的组织中出现，TGF-β1的表达水平亦与子宫内膜纤维化程度呈正相关[17]。Smad是参与TGF-β信号细胞内传导的一个蛋白家族，TGF-β1/Smad通路的失调可导致机体组织纤维化，Smad3和Smad4是TGF-β1的关键下游信号分子，Smad7为Smad家族的抑制性蛋白，活化的TGF-β1与细胞膜上的受体结合后可催化Smad3和Smad4磷酸化，使Smad3与Smad4结合后入核，进一步调控靶基因的转录活动[18-19]。在本研究中，模型组大鼠子宫组织TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表达和Smad3、Smad4蛋白磷酸化水平明显升高，Smad7 mRNA表达和Smad7蛋白磷酸化水平明显降低，使用补肾化瘀方治疗后，IUA大鼠的TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表达和Smad3、Smad4蛋白磷酸化减少，Smad7 mRNA表达和Smad7蛋白磷酸化增加，表明补肾化瘀方可抑制TGF-β1/Smad信号通路的激活。为了进一步探究补肾化瘀方对TGF-β1/Smad通路的调控作用，本研究使用了TGF-β通路激活剂SRI-011381，结果显示，SRI-011381明显削弱了补肾化瘀方对IUA大鼠子宫内膜纤维化的抑制作用，并进一步加重了纤维化病变和炎症反应，提示补肾化瘀方对IUA的治疗作用可能是通过抑制TGF-β1/Smad通路产生的。

综上所述，补肾化瘀方可能通过影响TGF-β1/Smad通路的活化改善IUA相关子宫内膜纤维化，初步揭示了补肾化瘀方治疗IUA的作用机制，但IUA是一种多因素疾病，病机复杂，补肾化瘀方治疗IUA的疗效及作用机制仍需进一步结合体外实验及临床研究加以阐明。