益气活血法干预脑缺血细胞凋亡信号通路作用机制的研究进展*

朱慧渊，王文蠧，罗 斌，苗 琦，董炳耀

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.西安医学院第二附属医院，陕西 西安 710068）

脑血管疾病是当今世界威胁人类健康与生存的重大疾病之一，其中又以脑缺血较为多见。脑缺血主要是由于血管栓塞造成脑血流量减少、脑组织血氧供应不足以致损伤[1]，后期产生脑细胞能量代谢障碍、炎症反应、兴奋性氨基酸毒性作用、氧化应激、细胞凋亡[2]、细胞自噬等一系列病理过程，最终导致神经功能障碍[3-4]。

研究[5]表明，脑缺血发生后，大脑不同缺血区域的神经细胞出现不同的变化，中心部分细胞坏死，半暗带区域则出现凋亡。细胞坏死具有不可逆性，只能通过调控半暗带缺血区相关细胞凋亡信号通路以减轻缺血性脑损伤。目前热点研究的细胞凋亡通路有Notch信号通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路、Janus激酶－信号转导和转录激活子（JAK/STAT）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、Fas/FasL信号通路和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）信号通路。这些细胞凋亡通路与细胞的生长及死亡有紧密联系。

中医益气活血法干预脑缺血研究呈现一种良好的发展趋势，涵盖了中医治疗的多个领域，包括辨证施治、传统古方[6]、经验方[7]、中药有效成分提取物[8]等，体现出益气活血法应用在防治脑缺血方面的优势。本文综述了近年来益气活血法干预脑缺血神经细胞凋亡的作用及机制研究进展。

1 中医学对脑缺血的认识

脑缺血归属于中医学“中风”的范畴，其病因病机涉及多种因素，包括气、血、风、痰、虚、火6种致病因素。在气血亏虚的基础上，受到饮食不节、内伤劳倦、情志所伤等影响，引起阴阳平衡失调、气血上逆入脑，最终导致脑脉闭阻不通[9]。

《黄帝内经》时期的“内虚邪中”学说认为本病的发病因素是因虚外感风邪所致。金元时期，朱丹溪提出“痰热生风”的思想，成为“内风”学说的早期萌芽。明清时期，叶天士提出“肝阳化风”的学说；王清任在此基础上，提出“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀”，认为“气虚血瘀”为中风病的关键致病因素，也贯穿整个疾病发展的各个时期。基于以上学术思想，众多医家提出不同的治疗大法，其中益气活血法是预防中风的重要原则，也是治疗中风的基本思路[9]。

气血互为根本，互为影响。气能生血，气能行血。血脉瘀滞，血行不畅，亦可阻碍气机的运行。因此，益气为新血生化之源，为治本之要；活血使新血再生，为治标之本[10]。临床治疗和实验研究也进一步证实，中医药治疗中风疗效确切[11]。研究表明，益气活血方药具有抗细胞凋亡、促进血管新生、抗缺血损伤等效应[12-13]。

2 益气活血法干预脑缺血细胞凋亡信号通路的作用机制

气虚血瘀是脑缺血的重要病机之一，故益气活血法为临床治疗脑缺血的主要治则之一[14]。益气活血法干预脑缺血可通过抗神经细胞凋亡、促神经再生、改善能量代谢，以达到抗缺血后脑损伤的保护作用。临床研究表明，益气活血方药可达到攻补兼施、益气活血、祛瘀通络的功效，从而改善脑缺血患者的生活质量，提高临床疗效[15]。目前针对益气活血法干预脑神经细胞凋亡的通路研究主要包括Notch 信号通路、PI3K/Akt信号通路、JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路、Fas/FasL信号通路、Caspase信号通路。

2.1 Notch信号通路 Notch信号通路的发现与果蝇体内突变相关，它与脑缺血后神经生长、发育密切相关，属于一条高度保守的信号通路。Notch信号通路主要由Notch受体、Notch配体、胞内效应分子等组成[16]。在缺血状态下，Notch信号通路可调控细胞凋亡、免疫炎症损伤、突触可塑性及神经发生等多个方面，且Notch信号通路在缺血再灌注的脑组织中，启动参与了脑缺血后的病理改变及功能恢复[17-18]。张滕飞[19]研究发现中风膏（古方“佛手散”为基础化裁）可促进脑缺血大鼠的神经功能修复，升高Notch1基因、神经生长因子（NGF）的阳性表达，其机制可能是调控Notch信号通路。研究[20]发现，大脑中动脉阻塞模型（MCAO）大鼠脑组织Notch1、Hes1及Hes5表达显著升高，补阳还五汤干预14 d后，MCAO大鼠Notch1、Hes1及Hes5表达显著增加，脑组织细胞与神经功能表达改善，提示Notch信号通路被激活对脑缺血再灌注损伤（CIRI）有保护作用，可通过调节下游效应分子Hes1、Hes5，达到调控神经干细胞（NSCs）的增殖和分化。参芎化瘀胶囊可提高缺血性脑卒中大鼠Notch1、血管内皮生长因子（VEGF）阳性蛋白的表达，进而改善神经细胞的形态和功能，并提高大鼠存活率[21]。研究[22]显示脑泰方（黄芪、川芎、地龙等）能够促进MCAO大鼠脑缺血再灌注损伤（CIRI）神经细胞再生，提高大鼠海马Nestin、Notch1阳性细胞表达，脑泰方可能通过调控Notch信号通路发挥保护脑细胞的作用。

2.2 PI3K/Akt信号通路 PI3K/Akt信号通路是调控细胞存活、生长和增殖的重要信号通路，在正常细胞中的表达量很少。当正常细胞受到刺激时，PI3K/Akt信号相关因子则被释放出来大量表达。激活后的PI3K迅速使细胞膜上的肌醇磷酸化，从而激活Akt。Akt被激活后继续激活其下游的信号因子，从而起到抗细胞凋亡的作用[23]。Akt亦称为蛋白激酶B，能直接磷酸化多重转录因子，并通过调控转录因子降低凋亡基因的表达，提高抗凋亡基因的表达，达到恢复细胞功能。

PI3K/Akt信号通路激活后，通过诱导血管内皮生长因子（VEGF）的表达进而促使血管再生，而此信号通路被抑制后，VEGF的表达明显降低，这提示PI3K/Akt信号通路激活后能够通过增强VEGF的表达发挥抗细胞凋亡的作用。研究[24]证实，抑制PI3K和Akt的磷酸化，阻断PI3K/Akt途径可抑制血管新生。

研究[25]表明，脑缺血后小鼠PI3K、Akt蛋白，以及PI3K mRNA、Akt mRNA表达均上升。补阳还五汤能改善脑缺血后小鼠神经功能，调控相关蛋白，进而发挥抗脑缺血损伤的作用。通心络在心脑血管疾病的治疗中应用范围广。研究[26]显示，通心络可通过激活PI3K/Akt通路，保护MCAO大鼠神经，明显减小脑梗死范围，降低神经细胞凋亡，改善神经功能。PDK1蛋白也是促使PI3K/Akt通路激活的重要蛋白分子，补阳还五汤能降低急性脑缺血再灌注大鼠血小板PDK1蛋白磷酸化水平，通过抑制PI3/Akt信号通路的激活，降低血小板活化程度，减少脑梗死面积，发挥抗脑损伤的作用。

2.3 JAK-STAT信号通路 JAK/STAT信号通路通过细胞因子刺激而发挥信号转导作用，主要参与细胞生长、分裂及凋亡等过程[28]。JAK-STAT通路由3个成分构成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK及转录因子STAT。JAK属于非跨膜型的酪氨酸激酶，其蛋白家族共包括4个成员：JAK1、JAK12、JAK3及Tyk2。JAK蛋白家族既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个具有特定结构域的信号分子。STAT被称为“信号转导子和转录激活子”，目前已发现它有6个家族成员，即STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5和STAT6。

脑络欣通方为新安医学益气活血法的代表中医复方，研究[29]发现，脑络欣通（黄芪30 g，三七3 g，川芎6 g，红花10 g，当归10 g，天麻10 g，蜈蚣2条）可通过JAK-STAT信号转导通路调节脑缺血再灌注（MCAO-R）大鼠模型NSCs增殖、分化。益气活血法效验方脑络欣通可能通过JAK-STAT信号转导通路，促进海马NSCs的迁移。脑心通临床多应用于气虚血滞、脉络瘀阻所致中风的治疗。研究[30]显示，CIRI大鼠脑组织中JAK2、STAT3表达增加。脑心通能降低CIRI大鼠脑组织JAK2、STAT3阳性表达，减少脑梗死体积，降低细胞凋亡数量，提示脑心通在一定程度上抑制了JAK2、STAT3信号通路，从而抑制神经细胞凋亡，修复脑神经功能，最终发挥保护脑组织的作用。

2.4 MAPK信号通路 MAPK属于丝蛋白/苏氨酸激酶家族。MAPK相关信号通路已被证实在细胞的生长分化、促使细胞凋亡损伤进程中具有明显作用。脑组织缺血缺氧产生后，中枢神经系统中的MAPK信号转导途径被诱导刺激活化，这一系列变化对神经元的生存与凋亡产生了关键的调控作用[31]。研究[32]显示，在众多亚族组成的MAPK通路中，大多数实验研究及临床研究探讨了p38MAPK、细胞外信号调节激酶（ERK-1/2）和c-Jun末端激酶（JNK）3个途径。p38MAPK通路是MAPK通路的重要组成通路之一，主要参与调控细胞核相关基因表达的转录，同时诱导细胞炎症反应、侵袭、凋亡、分化等重要生理过程的进行[33]。

此外，CIRI大鼠的海马神经细胞凋亡机制相关实验研究结果提示，与模型组比较，参芎化瘀胶囊组大鼠海马神经细胞凋亡数量明显下降，且p38MAPK阳性细胞数低于模型组；其机制与抑制p38MAPK信号转导通路激活，从而抑制神经细胞凋亡有关[34]。研究[35]显示，补阳还五汤具有保护神经及促进神经功能修复的作用，补阳还五汤能通过上调脑源性神经营养因子（BDNF）的阳性表达,激活MAPK/ERK信号通路,通过信号转导级联中的关键分子诱导神经细胞结构再塑，发挥抗神经细胞凋亡的作用。

2.5 Fas/FasL信号通路 Fas作为凋亡信号基因，其产物Fas蛋白是凋亡信号的受体。Fas配体（FasL）属于肿瘤坏死因子（TNF）超家族中的一种。

Fas蛋白通过介导死亡受体通路，在细胞凋亡中具有传递信号的功能。Fas蛋白作为凋亡信号的受体，可与FasL结合，两者均属于TNF超家族；FasL又称CD95L、APO-1L，为Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量为40 kD，是TNF超家族成员。FasL最经典的功能为诱导细胞凋亡。FasL与靶细胞表面受体Fas结合后，Fas胞内死亡结构域（death domain，DD）形态发生变化，聚集Fas相关死亡结构域（Fas-associated death domain，FADD）与之结合，FADD又可结合细胞质内的Caspase-8，Fas-FADD-Caspase-8组合成死亡诱导信号复合物（death-inducing signaling complex，DISC），诱导Caspase-8激活，活化的Caspase-8再进一步激活下游Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7从而导致细胞凋亡[36]。

Fas/FasL信号通路在细胞凋亡中发挥了不可或缺的作用，Fas与FasL相结合后触发信号通路下游一系列凋亡基因的级联反应，导致细胞凋亡。脑缺血发生后Fas、FasL蛋白表达明显增高，提示其是CIRI发病机制之一[37]。CIRI可以促进Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3蛋白的阳性表达，进而激活它们所在的信号通路引起神经元凋亡。脑缺血预处理可使Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3蛋白的表达水平下降，从而减少神经元的凋亡数量。因此，抑制Fas/FasL通路的激活可能是抗缺血性脑损伤的机制之一[38]。

研究[39]表明，参芎通脉颗粒预处理及治疗均能一定程度缓解脑缺血再灌注大鼠模型的神经损伤；与模型组比较，预处理组及治疗组Fas的表达降低（P＜0.05）。参芎通脉颗粒预处理和治疗均能抑制MCAO大鼠神经细胞的凋亡。脑健胶囊、康脑液均为临床经验方，由补阳还五汤化裁而来，由黄芪、丹参、川芎、钩藤、三七粉等组成，具有益气活血化瘀、清热平肝、息风定惊的作用。研究[40]显示，康脑液各剂量组能减少脑缺血大鼠梗死灶周边细胞Fas和Caspase-3表达，阻断细胞凋亡相关级联反应，促进神经元功能修复。

2.6 Caspase信号通路 Caspase家族分子具有很高的同源性，至今共发现14个家族成员，按发现的时间顺序依次命名为Caspase-1至Caspase-14。细胞凋亡的发生机制复杂，Caspase酶主要通过线粒体/Cytc通路、死亡受体通路和内质网通路3种形式完成。短暂MCAO后，Caspase相关活化过程持续达9 h，抑制Caspase后可以减少损伤。抑制Caspase为中风有效临床治疗时间窗的依据[41]。研究[42]发现，补阳还五汤能够明显降低脑缺血再灌注大鼠脑细胞凋亡百分比，并上调Bcl-2的阳性表达，下调Bax的阳性表达，降低Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白活性；提示补阳还五汤可以通过影响细胞凋亡相关蛋白的阳性表达，进而抑制神经细胞凋亡。此外，红景天苷可通过激活PI3K/Akt信号转导通路，上调PI3K、p-Akt的蛋白表达，抑制Caspase-3的蛋白表达，从而发挥对大鼠脑缺血-再灌注损伤抗凋亡的神经保护作用[43]。

3 总结与展望

脑缺血可以激活多条信号通路，这些信号通路之间存在着广泛的相互作用，其中由于大脑缺血缺氧引发的神经细胞凋亡在近几年的研究中备受瞩目。目前已有实验结果验证，中医复方防治中风具有明显的优势，可同时对神经细胞凋亡过程中相关多个环节多个方面进行有效调控，通过调节多条通路上下游靶点蛋白的表达，出现相应的生物学效应，进而降低脑缺血后神经元凋亡的数量，缓解缺血后脑组织损伤的严重程度。通过对这些信号通路的研究，我们亦发现这些通路是非单一的，而是一个复杂的瀑布式级联反应，并且在同一条通路中，也同时存在着促凋亡和抗凋亡两种不同的效应。但益气活血法的治疗机制非常繁杂，要阐明其具体机制需要我们后续不断研究和深入探讨。因此，我们后续将开展凋亡调控因子及其信号通路相关作用机制的系统研究，进一步探索神经元损伤的作用靶点和作用机制，为临床应用提供理论依据。